Alzheimers sygdom (AD) mangler proteinbiomarkører, der afspejler dens multiple underliggende patofysiologi, hvilket forhindrer fremskridt i diagnose og behandling. Her bruger vi omfattende proteomik til at identificere cerebrospinalvæske (CSF) biomarkører, der repræsenterer en bred vifte af AD patofysiologi. Multiplex massespektrometri identificerede ca. 3.500 og ca. 12.000 proteiner i henholdsvis AD CSF og hjernen. Netværksanalysen af hjerneproteomet løste 44 biodiversitetsmoduler, hvoraf 15 overlappede med cerebrospinalvæskeproteomet. CSF AD-markørerne i disse overlappende moduler er foldet i fem proteingrupper, der repræsenterer forskellige patofysiologiske processer. Synapserne og metabolitterne i AD-hjernen falder, men CSF øges, mens de glialrige myeliniserings- og immungrupper i hjernen og CSF øges. Konsistensen og sygdomsspecificiteten af panelændringerne blev bekræftet i mere end 500 yderligere CSF-prøver. Disse grupper identificerede også biologiske undergrupper i asymptomatisk AD. Samlet set er disse resultater et lovende skridt hen imod webbaserede biomarkørværktøjer til kliniske anvendelser i AD.
Alzheimers sygdom (AD) er den mest almindelige årsag til neurodegenerativ demens på verdensplan og er karakteriseret ved en lang række biologiske systemdysfunktioner, herunder synaptisk transmission, glia-medieret immunitet og mitokondriel metabolisme (1-3). Imidlertid fokuserer dets etablerede proteinbiomarkører stadig på at detektere amyloid- og tau-protein og kan derfor ikke afspejle denne forskelligartede patofysiologi. Disse "kerne" proteinbiomarkører, der er mest pålidelige målt i cerebrospinalvæske (CSF), omfatter (i) amyloid beta peptid 1-42 (Aβ1-42), som afspejler dannelsen af kortikale amyloid plaques; (ii) total tau, et tegn på axon degeneration; (iii) phospho-tau (p-tau), en repræsentant for patologisk tau-hyperphosphorylering (4-7). Selvom disse cerebrospinalvæske biomarkører i høj grad har lettet vores påvisning af "markerede" AD-proteinsygdomme (4-7), repræsenterer de kun en lille del af den komplekse biologi bag sygdommen.
Manglen på patofysiologisk mangfoldighed af AD-biomarkører har ført til mange udfordringer, herunder (i) manglende evne til at identificere og kvantificere den biologiske heterogenitet af AD-patienter, (ii) utilstrækkelig måling af sygdommens sværhedsgrad og progression, især i det prækliniske stadium, og ( iii) udviklingen af terapeutiske lægemidler, der ikke fuldstændigt løser alle aspekter af neurologisk forringelse. Vores afhængighed af skelsættende patologi til at beskrive AD fra relaterede sygdomme forværrer kun disse problemer. Flere og flere beviser viser, at de fleste ældre med demens har mere end én patologisk karakteristik af kognitiv tilbagegang (8). Så mange som 90 % eller flere af personer med AD-patologi har også vaskulær sygdom, TDP-43-inklusioner eller andre degenerative sygdomme (9). Disse høje andele af patologisk overlapning har forstyrret vores nuværende diagnostiske rammer for demens, og der er behov for en mere omfattende patofysiologisk definition af sygdommen.
I lyset af det presserende behov for en række AD-biomarkører, vedtager feltet i stigende grad "omics"-metoden baseret på det overordnede system til at opdage biomarkører. Accelerated Pharmaceutical Partnership (AMP)-AD Alliance blev lanceret i 2014 og er på forkant med programmet. Denne tværfaglige indsats fra National Institutes of Health, den akademiske verden og industrien har til formål at bruge systembaserede strategier til bedre at definere patofysiologien af AD og udvikle biodiversitetsdiagnostiske analyser og behandlingsstrategier (10). Som en del af dette projekt er netværksproteomik blevet et lovende værktøj til fremme af systembaserede biomarkører i AD. Denne objektive datadrevne tilgang organiserer komplekse proteomiske datasæt i grupper eller "moduler" af co-udtrykte proteiner, der er forbundet med specifikke celletyper, organeller og biologiske funktioner (11-13). Næsten 12 informationsrige netværksproteomiske undersøgelser er blevet udført på AD-hjernen (13-23). Samlet set indikerer disse analyser, at AD-hjernenetværksproteomet opretholder en meget bevaret modulær organisation i uafhængige kohorter og flere kortikale regioner. Derudover viser nogle af disse moduler reproducerbare ændringer i AD-relateret overflod på tværs af datasæt, hvilket afspejler patofysiologien af flere sygdomme. Samlet viser disse resultater et lovende ankerpunkt for opdagelsen af hjernenetværksproteomet som en systembaseret biomarkør i AD.
For at transformere AD-hjernenetværksproteomet til klinisk nyttige systembaserede biomarkører kombinerede vi det hjerneafledte netværk med den proteomiske analyse af AD CSF. Denne integrerede tilgang førte til identifikation af fem lovende sæt af CSF-biomarkører, der er forbundet med en bred vifte af hjernebaseret patofysiologi, herunder synapser, blodkar, myelinisering, inflammation og dysfunktion af metaboliske veje. Vi validerede disse biomarkørpaneler med succes gennem multiple replikationsanalyser, herunder mere end 500 CSF-prøver fra forskellige neurodegenerative sygdomme. Disse valideringsanalyser omfatter undersøgelse af gruppemål i CSF hos patienter med asymptomatisk AD (AsymAD) eller viser tegn på unormal amyloidakkumulering i et normalt kognitivt miljø. Disse analyser fremhæver den betydelige biologiske heterogenitet i AsymAD-populationen og identificerer panelmarkører, der kan være i stand til at subtype individer i de tidligste stadier af sygdommen. Samlet set repræsenterer disse resultater et nøgletrin i udviklingen af proteinbiomarkørværktøjer baseret på flere systemer, der med succes kan løse mange af de kliniske udfordringer, som AD står over for.
Hovedformålet med denne undersøgelse er at identificere nye cerebrospinalvæske biomarkører, der afspejler forskellige hjernebaserede patofysiologi, der fører til AD. Figur S1 skitserer vores forskningsmetodologi, som inkluderer (i) en omfattende analyse drevet af foreløbige fund af AD CSF og netværkshjerneproteomet for at identificere flere hjernerelaterede CSF-sygdomsbiomarkører og (ii) efterfølgende replikation Disse biomarkører er i flere uafhængige cerebrospinale flydende kohorter. Den opdagelsesorienterede forskning startede med analysen af den differentielle ekspression af CSF i 20 kognitivt normale individer og 20 AD-patienter ved Emory Goizueta Alzheimers Disease Research Center (ADRC). Diagnosen AD er defineret som en signifikant kognitiv svækkelse ved tilstedeværelse af lav Aβ1-42 og forhøjede niveauer af total tau og p-tau i cerebrospinalvæsken [Mean Montreal Cognitive Assessment (MoCA), 13,8 ± 7,0] [ELISA (ELISA) )]] (Tabel S1A). Kontrollen (gennemsnitlig MoCA, 26,7 ± 2,2) havde normale niveauer af CSF-biomarkører.
Human CSF er karakteriseret ved et dynamisk område af proteinoverflod, hvor albumin og andre ekstremt rigelige proteiner kan forhindre påvisning af proteiner af interesse (24). For at øge dybden af proteinopdagelsen fjernede vi de første 14 meget rigelige proteiner fra hver CSF-prøve før massespektrometri (MS) analyse (24). I alt 39.805 peptider blev identificeret af MS, som blev kortlagt til 3691 proteomer i 40 prøver. Protein kvantificering udføres ved multiple tandem masse tag (TMT) mærkning (18, 25). For at løse de manglende data inkluderede vi kun de proteiner, der blev kvantificeret i mindst 50% af prøverne i den efterfølgende analyse, hvorved vi endelig kvantificerede 2875 proteomer. På grund af den signifikante forskel i den samlede proteinoverflodsniveau blev en kontrolprøve statistisk betragtet som en outlier (13) og blev ikke inkluderet i den efterfølgende analyse. Abundanceværdierne for de resterende 39 prøver blev justeret i henhold til alder, køn og batch-kovarians (13-15, 17, 18, 20, 26).
Ved at bruge statistisk t-testanalyse til at evaluere differentiel ekspression på regressionsdatasættet identificerede denne analyse proteiner, hvis overflodsniveauer var signifikant ændret (P <0,05) mellem kontrol- og AD-tilfældene (tabel S2A). Som vist i figur 1A var overfloden af i alt 225 proteiner i AD signifikant reduceret, og overfloden af 303 proteiner var signifikant forøget. Disse differentielt udtrykte proteiner inkluderer adskillige tidligere identificerede cerebrospinalvæske AD-markører, såsom mikrotubuli-associeret protein tau (MAPT; P = 3,52 × 10−8), neurofilament (NEFL; P = 6,56 × 10−3), vækstrelateret protein 43 (GAP43; P = 1,46 × 10−5), Fedtsyrebindende Protein 3 (FABP3; P = 2,00 × 10−5), Chitinase 3 som 1 (CHI3L1; P = 4,44 × 10−6), Neural Granulin (NRGN; P = 3,43 × 10−4) og VGF nervevækstfaktor (VGF; P = 4,83 × 10−3) (4-6). Men vi identificerede også andre meget vigtige mål, såsom GDP-dissociationshæmmer 1 (GDI1; P = 1,54 × 10-10) og SPARC-relateret modulær calciumbinding 1 (SMOC1; P = 6,93 × 10-9). Gene Ontology (GO) analyse af 225 signifikant reducerede proteiner afslørede tætte forbindelser med kropsvæskeprocesser såsom steroidmetabolisme, blodkoagulation og hormonaktivitet (Figur 1B og Tabel S2B). I modsætning hertil er det signifikant øgede protein af 303 tæt forbundet med cellestruktur og energimetabolisme.
(A) Vulkanplottet viser log2-foldændringen (x-aksen) i forhold til -log10 statistiske P-værdi (y-aksen) opnået ved t-testen, som bruges til at detektere differentialekspression mellem kontrollen (CT) og AD tilfælde af CSF-proteomet af alle proteiner. Proteiner med signifikant reducerede niveauer (P <0,05) i AD er vist i blåt, mens proteiner med signifikant øgede niveauer i sygdom er vist med rødt. Det valgte protein er mærket. (B) De øverste GO-termer relateret til protein er signifikant reduceret (blå) og øget (rød) i AD. Viser de tre GO-termer med de højeste z-scores inden for biologiske processer, molekylære funktioner og cellulære komponenter. (C) MS målte MAPT-niveau i CSF-prøve (venstre) og dets korrelation med prøve-ELISA tau-niveau (højre). Pearson-korrelationskoefficienten med den relevante P-værdi vises. På grund af manglen på ELISA-data for et AD-tilfælde inkluderer disse tal værdier for 38 af de 39 analyserede tilfælde. (D) Overvåget klyngeanalyse (P <0,0001, Benjamini-Hochberg (BH) justeret P <0,01) på kontrollen og AD CSF fandt prøver ved hjælp af de 65 mest signifikant ændrede proteiner i datasættet. Standardiser, normaliser.
Det proteomiske niveau af MAPT er tæt forbundet med det uafhængigt målte ELISA tau-niveau (r = 0,78, P = 7,8 × 10-9; figur 1C), hvilket understøtter gyldigheden af vores MS-måling. Efter trypsinfordøjelse på niveauet for amyloid precursorprotein (APP) kan de isoformspecifikke peptider, der er kortlagt til C-terminalen af Aβ1-40 og Aβ1-42, ikke ioniseres effektivt (27, 28). Derfor har de APP-peptider, vi identificerede, intet at gøre med ELISA Aβ1-42-niveauer. For at evaluere den differentielle ekspression af hvert tilfælde brugte vi differentielt udtrykte proteiner med P <0,0001 [falsk opdagelseshastighed (FDR) korrigeret P <0,01] til at udføre en overvåget klyngeanalyse af prøverne (tabel S2A). Som vist i figur 1D kan disse 65 meget signifikante proteiner korrekt gruppere prøver i henhold til sygdomstilstand, bortset fra et AD-tilfælde med kontrollignende karakteristika. Af disse 65 proteiner steg 63 i AD, mens kun to (CD74 og ISLR) faldt. I alt har disse cerebrospinalvæskeanalyser identificeret hundredvis af proteiner i AD, der kan tjene som sygdomsbiomarkører.
Derefter udførte vi en uafhængig netværksanalyse af AD-hjerneproteomet. Hjernekohorten af denne opdagelse inkluderede dorsolateral præfrontal cortex (DLPFC) fra kontrol (n = 10), Parkinsons sygdom (PD; n = 10), blandet AD/PD (n = 10) og AD (n = 10) tilfælde. ) Prøve. Emery Goizueta ADRC. Demografien af disse 40 tilfælde er tidligere beskrevet (25) og er opsummeret i tabel S1B. Vi brugte TMT-MS til at analysere disse 40 hjernevæv og replikationskohorten på 27 tilfælde. I alt producerede disse to hjernedatasæt 227.121 unikke peptider, som blev kortlagt til 12.943 proteomer (25). Kun de proteiner, der blev kvantificeret i mindst 50 % af tilfældene, blev inkluderet i efterfølgende undersøgelser. Det endelige opdagelsesdatasæt indeholder 8817 kvantificerede proteiner. Juster proteinoverflodsniveauer baseret på alder, køn og post-mortem interval (PMI). Den differentielle ekspressionsanalyse af datasættet efter regression viste, at >2000 proteinniveauer var signifikant ændret [P <0,05, variansanalyse (ANOVA)] i to eller flere sygdomskohorter. Derefter udførte vi en overvåget klyngeanalyse baseret på de differentielt udtrykte proteiner og P <0,0001 i AD/kontrol og/eller AD/PD-sammenligninger (Figur S2, A og B, Tabel S2C). Disse 165 stærkt ændrede proteiner viser tydeligt tilfælde med AD-patologi fra kontrol- og PD-prøverne, hvilket bekræfter de stærke AD-specifikke ændringer i hele proteomet.
Vi brugte derefter en algoritme kaldet Weighted Gene Co-expression Network Analysis (WGCNA) til at udføre netværksanalyse på det opdagede hjerneproteom, som organiserer datasættet i proteinmoduler med lignende ekspressionsmønstre (11-13). Analysen identificerede 44 moduler (M) co-udtrykte proteiner, sorteret og nummereret fra de største (M1, n = 1821 proteiner) til de mindste (M44, n = 34 proteiner) (Figur 2A og Tabel S2D) ). Som nævnt ovenfor (13) Beregn den repræsentative ekspressionsprofil eller karakteristiske protein for hvert modul, og korreler det med sygdomstilstanden og AD-patologien, dvs. etablere alliancen mellem Alzheimers sygdomsregister (CERAD) og Braak-score (figur 2B). Samlet set var 17 moduler signifikant relateret til AD neuropatologi (P <0,05). Mange af disse sygdomsrelaterede moduler er også rige på celletypespecifikke markører (figur 2B). Som nævnt ovenfor (13) bestemmes celletypeberigelse ved at analysere moduloverlapningen og referencelisten over celletypespecifikke gener. Disse gener er afledt af offentliggjorte data i isolerede museneuroner, endotel- og gliaceller. RNA-sekventering (RNA-seq) eksperiment (29).
(A) Opdag WGCNA af hjerneproteomet. (B) Bivægt-midkorrelationsanalyse (BiCor) af det modulære signaturprotein (den første hovedkomponent af modulært proteinekspression) med AD neuropatologiske karakteristika (øverst), herunder CERAD (Aβ-plak) og Braak (tau-tangles)-scorer. Intensiteterne af positive (røde) og negative (blå) korrelationer er vist af et tofarvet varmekort, og stjerner angiver statistisk signifikans (P <0,05). Brug Hypergeometric Fisher's Exact Test (FET) (nederst) til at vurdere celletypeassocieringen af hvert proteinmodul. Intensiteten af den røde skygge angiver graden af celletypeberigelse, og asterisken angiver statistisk signifikans (P <0,05). Brug BH-metoden til at korrigere P-værdien afledt af FET. (C) GO-analyse af modulære proteiner. De mest beslægtede biologiske processer er vist for hvert modul eller beslægtet modulgruppe. oligo, oligodendrocyt.
Et sæt af fem nært beslægtede astrocyt- og mikroglia-rige moduler (M30, M29, M18, M24 og M5) viste en stærk positiv korrelation med AD neuropatologi (figur 2B). Ontologianalyse forbinder disse gliamoduler med cellevækst, proliferation og immunitet (figur 2C og tabel S2E). To yderligere gliamoduler, M8 og M22, er også stærkt opregulerede ved sygdom. M8 er meget relateret til den Toll-lignende receptor-pathway, en signaleringskaskade, der spiller en nøglerolle i det medfødte immunrespons (30). Samtidig er M22 tæt forbundet med post-translationel modifikation. M2, som er rig på oligodendrocytter, viser en stærk positiv korrelation med AD-patologi og en ontologisk forbindelse med nukleosidsyntese og DNA-replikation, hvilket indikerer øget celleproliferation i sygdomme. Samlet set understøtter disse resultater den forhøjelse af gliale moduler, som vi tidligere har observeret i AD-netværksproteomet (13, 17). Det er i øjeblikket fundet, at mange AD-relaterede gliamoduler i netværket viser lavere ekspressionsniveauer i kontrol- og PD-tilfælde, hvilket fremhæver deres sygdomsspecificitet, der er forhøjet i AD (Figur S2C).
Kun fire moduler i vores netværksproteom (M1, M3, M10 og M32) er stærkt negativt korreleret med AD-patologi (P <0,05) (Figur 2, B og C). Både M1 og M3 er rige på neuronale markører. M1 er meget relateret til synaptiske signaler, mens M3 er tæt relateret til mitokondriel funktion. Der er ingen tegn på celletypeberigelse for M10 og M32. M32 afspejler sammenhængen mellem M3 og cellemetabolisme, mens M10 er stærkt relateret til cellevækst og mikrotubulus funktion. Sammenlignet med AD er alle fire moduler øget i kontrol og PD, hvilket giver dem sygdomsspecifikke AD-ændringer (figur S2C). Samlet set understøtter disse resultater den reducerede overflod af neuronrige moduler, som vi tidligere har observeret i AD (13, 17). Sammenfattende producerede netværksanalysen af hjerneproteomet, som vi opdagede, AD-specifikt ændrede moduler i overensstemmelse med vores tidligere fund.
AD er karakteriseret ved et tidligt asymptomatisk stadium (AsymAD), hvor individer udviser amyloidakkumulering uden klinisk kognitiv tilbagegang (5, 31). Dette asymptomatiske stadium repræsenterer et kritisk vindue for tidlig opdagelse og intervention. Vi har tidligere demonstreret stærk modulær bevaring af AsymAD og AD hjernenetværksproteom på tværs af uafhængige datasæt (13, 17). For at sikre, at det hjernenetværk, vi i øjeblikket opdagede, er i overensstemmelse med disse tidligere resultater, analyserede vi bevarelsen af 44 moduler i det replikerede datasæt fra 27 DLPFC-organisationer. Disse organisationer omfatter kontrol (n = 10), AsymAD (n = 8) og AD (n = 9) tilfælde. Kontrol- og AD-prøver blev inkluderet i analysen af vores opdagelseshjernekohorte (tabel S1B), mens AsymAD-tilfælde kun var unikke i replikationskohorten. Disse AsymAD-tilfælde kom også fra Emory Goizueta ADRC-hjernebanken. Selvom kognitionen var normal på dødstidspunktet, var amyloidniveauerne unormalt høje (gennemsnitlig CERAD, 2,8 ± 0,5) (tabel S1B).
TMT-MS-analyse af disse 27 hjernevæv resulterede i kvantificeringen af 11.244 proteomer. Denne endelige optælling inkluderer kun de proteiner, der er kvantificeret i mindst 50 % af prøverne. Dette replikerede datasæt indeholder 8638 (98,0%) af de 8817 proteiner, der er påvist i vores opdagelseshjerneanalyse, og har næsten 3000 signifikant ændrede proteiner mellem kontrol- og AD-kohorterne (P <0,05, efter Tukeys parrede t-test til variansanalyse) ( Tabel S2F). Blandt disse differentielt udtrykte proteiner viste 910 også signifikante niveauændringer mellem AD og hjerneproteomkontroltilfælde (P <0,05, efter ANOVA Tukey parret t-test). Det er værd at bemærke, at disse 910 markører er meget konsistente i retningen af ændring mellem proteomer (r = 0,94, P <1,0 × 10-200) (figur S3A). Blandt de øgede proteiner er proteinerne med de mest konsistente ændringer mellem datasæt hovedsageligt medlemmer af de glialrige M5- og M18-moduler (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1 og GFAP). Blandt de reducerede proteiner var dem med de mest konsistente ændringer næsten udelukkende medlemmer af M1-modulet (NPTX2, VGF og RPH3A) forbundet med synapsen. Vi verificerede yderligere de AD-relaterede ændringer af midkine (MDK), CD44, udskilt frizzled-relateret protein 1 (SFRP1) og VGF ved western blotting (figur S3B). Modulbevaringsanalyse viste, at omkring 80% af proteinmodulerne (34/44) i hjerneproteomet var signifikant konserveret i replikationsdatasættet (z-score> 1,96, FDR-korrigeret P <0,05) (figur S3C). Fjorten af disse moduler var specielt reserveret mellem de to proteomer (z-score> 10, FDR-korrigeret P <1,0 × 10-23). Samlet set fremhæver opdagelsen og replikationen af den høje grad af konsistens i differentiel ekspression og modulær sammensætning mellem hjerneproteomet reproducerbarheden af ændringerne i AD frontale cortex-proteiner. Derudover bekræftede den også, at AsymAD og mere avancerede sygdomme har en meget lignende hjernenetværksstruktur.
En mere detaljeret analyse af det differentielle udtryk i hjernereplikationsdatasættet fremhæver den betydelige grad af AsymAD-proteinændringer, herunder i alt 151 signifikant ændrede proteiner mellem AsymAD og kontrollen (P <0,05) (Figur S3D). I overensstemmelse med amyloidbelastningen steg APP i hjernen af AsymAD og AD signifikant. MAPT ændrer sig kun signifikant i AD, hvilket er i overensstemmelse med øgede niveauer af sammenfiltringer og dets kendte korrelation med kognitiv tilbagegang (5, 7). De glialrige moduler (M5 og M18) afspejles i høj grad i de øgede proteiner i AsymAD, mens det neuronrelaterede M1-modul er det mest repræsentative for de reducerede proteiner i AsymAD. Mange af disse AsymAD-markører viser større ændringer i symptomatiske sygdomme. Blandt disse markører er SMOC1, et gliaprotein tilhørende M18, som er forbundet med hjernetumorer og udvikling af øjne og lemmer (32). MDK er en heparinbindende vækstfaktor relateret til cellevækst og angiogenese (33), et andet medlem af M18. Sammenlignet med kontrolgruppen steg AsymAD signifikant, efterfulgt af en større stigning i AD. I modsætning hertil blev det synaptiske protein neuropentraxin 2 (NPTX2) signifikant reduceret i AsymAD-hjernen. NPTX2 var tidligere forbundet med neurodegeneration og har en anerkendt rolle i at formidle excitatoriske synapser (34). Samlet set afslører disse resultater en række forskellige prækliniske proteinændringer i AD, der ser ud til at udvikle sig med sygdommens sværhedsgrad.
I betragtning af at vi har opnået en betydelig dybde af proteindækning i opdagelsen af hjerneproteomet, forsøger vi at forstå mere fuldstændigt dets overlap med AD-transkriptomet på netværksniveau. Derfor sammenlignede vi det hjerneproteom, vi opdagede, med det modul, vi tidligere genererede fra mikroarray-målingen af 18.204 gener i AD (n = 308) og kontrol (n = 157) DLPFC-væv (13). overlappende. I alt identificerede vi 20 forskellige RNA-moduler, hvoraf mange demonstrerede berigelsen af specifikke celletyper, herunder neuroner, oligodendrocytter, astrocytter og mikroglia (figur 3A). De multiple ændringer af disse moduler i AD er vist i figur 3B. I overensstemmelse med vores tidligere protein-RNA-overlapningsanalyse ved brug af det dybere umærkede MS-proteom (ca. 3000 proteiner) (13), er de fleste af de 44 moduler i hjerneproteomnetværket, vi fandt, i transkriptomnetværket. Der er ingen signifikant overlapning i. Selv i vores opdagelse og replikation af de 34 proteinmoduler, der er meget tilbageholdt i hjerneproteomet, viste kun 14 (~40%) Fishers eksakte test (FET) sig at have et statistisk signifikant overlap med transkriptomet (figur 3A). Kompatibel med reparation af DNA-skader (P-M25 og P-M19), proteintranslation (P-M7 og P-M20), RNA-binding/splejsning (P-M16 og P-M21) og proteinmålretning (P-M13 og P- M23) overlapper ikke med moduler i transkriptomet. Derfor, selvom et dybere proteomdatasæt bruges i den aktuelle overlapningsanalyse (13), er det meste af AD-netværksproteomet ikke kortlagt til transkriptomnetværket.
(A) Hypergeometrisk FET demonstrerer berigelsen af celletypespecifikke markører i RNA-modulet i AD-transkriptomet (øverst) og graden af overlap mellem RNA- (x-aksen) og protein- (y-aksen) moduler i AD-hjernen (nederst). Intensiteten af den røde skygge angiver graden af berigelse af celletyper i toppanelet og intensiteten af overlapningen af modulerne i bundpanelet. Stjerner angiver statistisk signifikans (P <0,05). (B) Graden af korrelation mellem de karakteristiske gener for hvert transkriptommodul og AD-status. Modulerne til venstre er de mest negativt korrelerede med AD (blå), og dem til højre er de mest positivt korrelerede med AD (rød). Den log-transformerede BH-korrigerede P-værdi angiver graden af statistisk signifikans af hver korrelation. (C) Betydelige overlappende moduler med delt celletypeberigelse. (D) Korrelationsanalyse af log2-foldsændringen af det mærkede protein (x-akse) og RNA (y-akse) i det overlappende modul. Pearson-korrelationskoefficienten med den relevante P-værdi vises. Mikro, mikroglia; himmellegemer, astrocytter. CT, kontrol.
De fleste overlappende protein- og RNA-moduler deler lignende celletypeberigelsesprofiler og konsekvente AD-ændringsretninger (figur 3, B og C). Med andre ord er det synapse-relaterede M1-modul af hjerneproteomet (PM1) kortlagt til tre neuronrige homologe RNA-moduler (R-M1, R-M9 og R-M16), som er i AD. Begge viste et reduceret niveau. Tilsvarende overlapper de glialrige M5- og M18-proteinmoduler med RNA-moduler rige på astrocytter og mikrogliale markører (R-M3, R-M7 og R-M10) og er meget involveret i sygdomsforøgelse. Disse delte modulære funktioner mellem de to datasæt understøtter yderligere celletypeberigelsen og sygdomsrelaterede ændringer, vi har observeret i hjerneproteomet. Imidlertid observerede vi mange signifikante forskelle mellem RNA- og proteinniveauerne af individuelle markører i disse delte moduler. Korrelationsanalyse af den differentielle ekspression af proteomikken og transkriptomikken af molekylerne inden for disse overlappende moduler (figur 3D) fremhæver denne inkonsistens. For eksempel viste APP og flere andre gliamodulproteiner (NTN1, MDK, COL25A1, ICAM1 og SFRP1) en signifikant stigning i AD-proteomet, men der var næsten ingen ændring i AD-transkriptomet. Disse proteinspecifikke ændringer kan være tæt forbundet med amyloide plaques (23, 35), hvilket fremhæver proteomet som kilden til patologiske ændringer, og disse ændringer afspejles muligvis ikke i transkriptomet.
Efter uafhængig analyse af hjerne- og CSF-proteomerne, vi opdagede, udførte vi en omfattende analyse af de to datasæt for at identificere AD CSF-biomarkører relateret til patofysiologien af hjernenetværket. Vi skal først definere overlapningen af de to proteomer. Selvom det er almindeligt accepteret, at CSF afspejler neurokemiske ændringer i AD-hjernen (4), er den nøjagtige grad af overlapning mellem AD-hjernen og CSF-proteomet uklar. Ved at sammenligne antallet af delte genprodukter påvist i vores to proteomer fandt vi ud af, at næsten 70% (n = 1936) af proteinerne identificeret i cerebrospinalvæsken også blev kvantificeret i hjernen (figur 4A). De fleste af disse overlappende proteiner (n = 1721) er kortlagt til et af 44 co-ekspressionsmoduler fra opdagelseshjernedatasættet (Figur 4B). Som forventet udviste de seks største hjernemoduler (M1 til M6) den største mængde CSF-overlap. Der er dog mindre hjernemoduler (for eksempel M15 og M29), der opnår en uventet høj grad af overlap, større end et hjernemodul dobbelt så stort. Dette motiverer os til at anvende en mere detaljeret, statistisk drevet metode til at beregne overlapningen mellem hjernen og cerebrospinalvæsken.
(A og B) Proteinerne påvist i opdagelseshjernen og CSF-datasæt overlapper hinanden. De fleste af disse overlappende proteiner er forbundet med et af de 44 co-ekspressionsmoduler i hjernens co-ekspressionsnetværk. (C) Opdag overlapningen mellem cerebrospinalvæskeproteomet og hjernenetværksproteomet. Hver række af varmekortet repræsenterer en separat overlapningsanalyse af den hypergeometriske FET. Den øverste række viser overlapningen (grå/sort skygge) mellem hjernemodulet og hele CSF-proteomet. Den anden linje viser, at overlapningen mellem hjernemoduler og CSF-protein (skraveret i rødt) er signifikant opreguleret i AD (P <0,05). Den tredje række viser, at overlapningen mellem hjernemoduler og CSF-protein (blå skygge) er signifikant nedreguleret i AD (P <0,05). Brug BH-metoden til at korrigere P-værdien afledt af FET. (D) Foldemodulpanel baseret på celletypetilknytning og relaterede GO-udtryk. Disse paneler indeholder i alt 271 hjernerelaterede proteiner, som har meningsfuldt differentielt udtryk i CSF-proteomet.
Ved hjælp af enkelthalede FET'er vurderede vi vigtigheden af proteinoverlap mellem CSF-proteomet og individuelle hjernemoduler. Analysen afslørede, at i alt 14 hjernemoduler i CSF-datasættet har statistisk signifikante overlapninger (FDR justeret P <0,05), og et yderligere modul (M18), hvis overlap er tæt på signifikans (FDR justeret P = 0,06) (Figur 4C) , øverste række). Vi er også interesserede i moduler, der stærkt overlapper med differentielt udtrykte CSF-proteiner. Derfor anvendte vi to yderligere FET-analyser for at bestemme, hvilket af (i) CSF-protein der var signifikant øget i AD og (ii) CSF-protein var signifikant reduceret i AD (P <0,05, parret t-test AD/kontrol) Hjernemoduler med meningsfuldt overlap mellem dem. Som vist i den midterste og nederste række i figur 4C viser disse yderligere analyser, at 8 af de 44 hjernemoduler signifikant overlapper med proteinet tilsat i AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33 og M38) . ), mens kun to moduler (M6 og M15) viste et meningsfuldt overlap med det reducerede protein i AD CSF. Som forventet er alle 10 moduler i de 15 moduler med det højeste overlap med CSF-proteomet. Derfor antager vi, at disse 15 moduler er højudbyttekilder til AD-hjerneafledte CSF-biomarkører.
Vi foldede disse 15 overlappende moduler til fem store proteinpaneler baseret på deres nærhed i WGCNA-trædiagrammet og deres tilknytning til celletyper og genontologi (figur 4D). Det første panel indeholder moduler rige på neuronmarkører og synapse-relaterede proteiner (M1 og M12). Det synaptiske panel indeholder i alt 94 proteiner, og niveauerne i CSF-proteomet har ændret sig betydeligt, hvilket gør det til den største kilde til hjernerelaterede CSF-markører blandt de fem paneler. Den anden gruppe (M6 og M15) demonstrerede den tætte forbindelse med endotelcellemarkører og vaskulær krop, såsom "sårheling" (M6) og "regulering af humoral immunrespons" (M15). M15 er også stærkt relateret til lipoproteinmetabolisme, som er tæt beslægtet med endotel (36). Det vaskulære panel indeholder 34 CSF-markører relateret til hjernen. Den tredje gruppe omfatter moduler (M2 og M4), der er signifikant relateret til oligodendrocytmarkører og celleproliferation. For eksempel inkluderer topniveau-ontologitermerne for M2 "positiv regulering af DNA-replikation" og "purinbiosynteseproces". I mellemtiden inkluderer dem af M4 "glialcelledifferentiering" og "kromosomsegregering". Myeliniseringspanelet indeholder 49 CSF-markører relateret til hjernen.
Den fjerde gruppe indeholder flest moduler (M30, M29, M18, M24 og M5), og næsten alle moduler er betydeligt rige på mikroglia- og astrocytmarkører. I lighed med myelineringspanelet indeholder det fjerde panel også moduler (M30, M29 og M18), der er tæt beslægtet med celleproliferation. De andre moduler i denne gruppe er stærkt relateret til immunologiske termer, såsom "immun effektproces" (M5) og "immunresponsregulering" (M24). Glialimmungruppen indeholder 42 CSF-markører relateret til hjernen. Endelig indeholder det sidste panel 52 hjernerelaterede markører på de fire moduler (M44, M3, M33 og M38), som alle er på kroppen relateret til energilagring og metabolisme. Det største af disse moduler (M3) er tæt beslægtet med mitokondrier og er rig på neuronspecifikke markører. M38 er et af de mindre modulmedlemmer i dette metabolom og udviser også moderat neuronspecificitet.
Samlet set afspejler disse fem paneler en bred vifte af celletyper og funktioner i AD cortex og indeholder tilsammen 271 hjernerelaterede CSF-markører (tabel S2G). For at evaluere validiteten af disse MS-resultater brugte vi proximity extension assay (PEA), en ortogonal antistof-baseret teknologi med multiplekseringsevner, høj sensitivitet og specificitet, og genanalyserede cerebrospinalvæskeprøverne, vi fandt en undergruppe af disse 271 biomarkører (n = 36). Disse 36 mål demonstrerer ændringen i AD-multiple af PEA, som er tæt relateret til vores MS-baserede resultater (r = 0,87, P = 5,6 × 10-12), som stærkt bekræftede resultaterne af vores omfattende MS-analyse (Figur S4) ).
De biologiske temaer, der fremhæves af vores fem grupper, fra synaptisk signalering til energimetabolisme, er alle relateret til patogenesen af AD (1-3). Derfor er alle 15 moduler, der indeholder disse paneler, relateret til AD-patologien i hjerneproteomet, som vi opdagede (figur 2B). Den mest bemærkelsesværdige er den høje positive patologiske korrelation mellem vores gliale moduler og den stærke negative patologiske korrelation mellem vores største neuronale moduler (M1 og M3). Den differentielle ekspressionsanalyse af vores replikerede hjerneproteom (figur S3D) fremhæver også M5- og M18-afledte gliaproteiner. Ved AsymAD og symptomatisk AD er de mest øgede gliaproteiner og M1-relaterede synapser. Proteinet reduceres mest. Disse observationer indikerer, at de 271 cerebrospinalvæskemarkører, vi identificerede i de fem grupper, er relateret til sygdomsprocesser i AD cortex, inklusive dem, der forekommer i de tidlige asymptomatiske stadier.
For bedre at kunne analysere ændringsretningen af panelproteinerne i hjernen og spinalvæsken tegnede vi følgende for hvert af de 15 overlappende moduler: (i) fandt moduloverflodsniveauet i hjernedatasættet og (ii) modulet protein Forskellen er udtrykt i cerebrospinalvæsken (Figur S5). Som tidligere nævnt bruges WGCNA til at bestemme modulmængden eller den karakteristiske proteinværdi i hjernen (13). Vulkankortet bruges til at beskrive den differentielle ekspression af modulære proteiner i cerebrospinalvæsken (AD/kontrol). Disse tal viser, at tre af de fem paneler viser forskellige udtrykstendenser i hjernen og spinalvæsken. De to moduler i synapsepanelet (M1 og M12) viser et fald i overflodsniveauet i AD-hjernen, men overlapper signifikant med det øgede protein i AD CSF (Figur S5A). De neuronrelaterede moduler indeholdende metabolomet (M3 og M38) viste lignende hjerne- og cerebrospinalvæskeekspressionsmønstre inkonsekvente (figur S5E). Det vaskulære panel viste også forskellige ekspressionstendenser, selvom dets moduler (M6 og M15) var moderat forøget i AD-hjernen og faldet i den syge CSF (Figur S5B). De resterende to paneler indeholder store gliale netværk, hvis proteiner konsekvent opreguleres i begge rum (figur S5, C og D).
Bemærk venligst, at disse tendenser ikke er fælles for alle markører i disse paneler. For eksempel inkluderer det synaptiske panel adskillige proteiner, der er signifikant reduceret i AD-hjernen og CSF (Figur S5A). Blandt disse nedregulerede cerebrospinalvæskemarkører er NPTX2 og VGF af M1 og chromogranin B af M12. Men på trods af disse undtagelser er de fleste af vores synaptiske markører forhøjet i AD spinalvæske. Samlet set var disse analyser i stand til at skelne statistisk signifikante tendenser i hjerne- og cerebrospinalvæskeniveauer i hver af vores fem paneler. Disse tendenser fremhæver det komplekse og ofte anderledes forhold mellem hjerne- og CSF-proteinekspression i AD.
Derefter brugte vi high-throughput MS-replikationsanalyse (CSF-replikation 1) til at indsnævre vores 271 sæt biomarkører til de mest lovende og reproducerbare mål (figur 5A). CSF-kopi 1 indeholder i alt 96 prøver fra Emory Goizueta ADRC, inklusive kontrol-, AsymAD- og AD-kohorte (tabel S1A). Disse AD-tilfælde er karakteriseret ved mild kognitiv tilbagegang (gennemsnitlig MoCA, 20,0 ± 3,8) og ændringer i AD-biomarkører bekræftet i cerebrospinalvæske (tabel S1A). I modsætning til CSF-analysen, vi fandt, udføres denne replikation ved hjælp af en mere effektiv og høj-throughput "single-shot" MS-metode (uden off-line fraktionering), herunder en forenklet prøveforberedelsesprotokol, der eliminerer behovet for immundepletion af individuelle prøver . I stedet bruges en enkelt immundepleteret "forstærkningskanal" til at forstærke signalet fra mindre rigelige proteiner (37). Selvom den reducerer den totale proteomdækning, reducerer denne enkeltskudsmetode maskintiden betydeligt og øger antallet af TMT-mærkede prøver, der kan analyseres levedygtige (17, 38). I alt identificerede analysen 6.487 peptider, som blev kortlagt til 1.183 proteomer i 96 tilfælde. Som med CSF-analysen, vi fandt, blev kun de proteiner kvantificeret i mindst 50% af prøverne inkluderet i de efterfølgende beregninger, og dataene blev regresseret for virkningerne af alder og køn. Dette førte til den endelige kvantificering af 792 proteomer, hvoraf 95% også blev identificeret i det fundne CSF-datasæt.
(A) Hjernerelaterede CSF-proteinmål verificeret i den første replikerede CSF-kohorte og inkluderet i det endelige panel (n = 60). (B til E) Panelbiomarkørniveauer (sammensatte z-scores) målt i de fire CSF-replikationskohorter. Parrede t-tests eller ANOVA med Tukeys postkorrektion blev brugt til at evaluere den statistiske signifikans af ændringerne i overflod i hver replikatanalyse. CT, kontrol.
Da vi er særligt interesserede i at verificere vores 271 hjernerelaterede CSF-mål gennem omfattende analyse, vil vi begrænse yderligere undersøgelse af dette replikerede proteom til disse markører. Blandt disse 271 proteiner blev 100 påvist i CSF-replikation 1. Figur S6A viser den differentielle ekspression af disse 100 overlappende markører mellem kontrol- og AD-replikationsprøverne. Synaptiske histoner og metabolithistoner stiger mest ved AD, mens vaskulære proteiner falder mest ved sygdom. De fleste af de 100 overlappende markører (n = 70) opretholdt den samme ændringsretning i de to datasæt (figur S6B). Disse 70 validerede hjernerelaterede CSF-markører (tabel S2H) afspejler stort set de tidligere observerede panelekspressionstendenser, det vil sige nedreguleringen af vaskulære proteiner og opreguleringen af alle andre paneler. Kun 10 af disse 70 validerede proteiner viste ændringer i AD-overflod, der modsiger disse paneltendenser. For at generere et panel, der bedst afspejler den overordnede tendens i hjernen og cerebrospinalvæsken, udelukkede vi disse 10 proteiner fra panelet af interesse, som vi endelig verificerede (figur 5A). Derfor inkluderer vores panel i sidste ende i alt 60 proteiner verificeret i to uafhængige CSF AD-kohorter ved hjælp af forskellig prøveforberedelse og MS-platformanalyse. Z-score-ekspressionsplottene for disse sidste paneler i CSF-kopi 1-kontrol- og AD-tilfældene bekræftede paneltendensen observeret i CSF-kohorten, vi fandt (figur 5B).
Blandt disse 60 proteiner er der molekyler, der vides at være forbundet med AD, såsom osteopontin (SPP1), som er et pro-inflammatorisk cytokin, der er blevet forbundet med AD i mange undersøgelser (39-41), og GAP43, et synaptisk protein der er klart forbundet med neurodegeneration (42). De mest fuldt verificerede proteiner er markører relateret til andre neurodegenerative sygdomme, såsom amyotrofisk lateral sklerose (ALS) relateret superoxiddismutase 1 (SOD1) og Parkinsons sygdomsrelateret desaccharase (PARK7). Vi har også verificeret, at mange andre markører, såsom SMOC1 og hjernerig membranvedhæftningssignalprotein 1 (BASP1), har begrænsede tidligere forbindelser til neurodegeneration. Det er værd at bemærke, at på grund af deres lave overordnede overflod i CSF-proteomet, er det vanskeligt for os at bruge denne high-throughput single-shot detektionsmetode til pålideligt at detektere MAPT og visse andre AD-relaterede proteiner (for eksempel NEFL og NRGN ) (43, 44).
Vi tjekkede derefter disse 60 prioritetspanelmarkører i tre yderligere replikatanalyser. I CSF-kopi 2 brugte vi en enkelt TMT-MS til at analysere en uafhængig kohorte af 297 kontrol- og AD-prøver fra Emory Goizueta ADRC (17). CSF-replikation 3 inkluderede en reanalyse af tilgængelige TMT-MS-data fra 120 kontrol- og AD-patienter fra Lausanne, Schweiz (45). Vi opdagede mere end to tredjedele af de 60 prioritetsmarkører i hvert datasæt. Selvom den schweiziske undersøgelse brugte forskellige MS-platforme og TMT-kvantificeringsmetoder (45, 46), reproducerede vi kraftigt vores paneltendenser i to gentagne analyser (figur 5, C og D og tabel S2, I og J). For at evaluere sygdomsspecificiteten i vores gruppe brugte vi TMT-MS til at analysere det fjerde replikationsdatasæt (CSF-replikation 4), som ikke kun omfattede kontrol- (n = 18) og AD (n = 17) tilfælde, men også PD ( n = 14)), ALS (n = 18) og frontotemporal demens (FTD) prøver (n = 11) (tabel S1A). Vi kvantificerede med succes næsten to tredjedele af panelproteinerne i denne kohorte (38 ud af 60). Disse resultater fremhæver de AD-specifikke ændringer i alle fem biomarkørpaneler (figur 5E og tabel S2K). Stigningen i metabolitgruppen viste den stærkeste AD-specificitet efterfulgt af myeliniserings- og gliagruppen. I mindre grad viser FTD også en stigning mellem disse paneler, hvilket kan afspejle lignende potentielle netværksændringer (17). I modsætning hertil viste ALS og PD næsten de samme myeliniserings-, glial- og metabolomprofiler som kontrolgruppen. På trods af forskelle i prøveforberedelse, MS-platform og TMT-kvantificeringsmetoder viser disse gentagne analyser, at vores prioriterede panelmarkører har meget konsistente AD-specifikke ændringer i mere end 500 unikke CSF-prøver.
AD neurodegeneration er blevet bredt anerkendt flere år før debut af kognitive symptomer, så der er et presserende behov for biomarkører for AsymAD (5, 31). Men flere og flere beviser viser, at biologien af AsymAD langt fra er homogen, og det komplekse samspil mellem risiko og modstandsdygtighed fører til store individuelle forskelle i efterfølgende sygdomsprogression (47). Selvom det bruges til at identificere AsymAD-tilfælde, har niveauerne af kerne-CSF-biomarkører (Aβ1-42, total tau og p-tau) ikke vist sig at være i stand til pålideligt at forudsige, hvem der vil udvikle sig til demens (4, 7), hvilket indikerer mere. nødvendigt at inkludere holistiske biomarkørværktøjer baseret på flere aspekter af hjernefysiologi for nøjagtigt at stratificere risikoen for denne befolkning. Derfor analyserede vi efterfølgende vores AD-validerede biomarkørpanel i AsymAD-populationen af CSF-kopi 1. Disse 31 AsymAD-tilfælde viste unormale kernebiomarkørniveauer (Aβ1-42/total tau ELISA-forhold, <5,5) og fuldstændig kognition (gennemsnitlig MoCA, 27,1 ± 2,2) (Tabel S1A). Derudover har alle personer med AsymAD en klinisk demensscore på 0, hvilket indikerer, at der ikke er tegn på et fald i den daglige kognitive eller funktionelle ydeevne.
Vi analyserede først niveauerne af de validerede paneler i alle 96 CSF-replikater 1, inklusive AsymAD-kohorten. Vi fandt ud af, at flere paneler i AsymAD-gruppen havde signifikante AD-lignende abundanceændringer, det vaskulære panel viste en nedadgående tendens i AsymAD, mens alle andre paneler viste en opadgående tendens (figur 6A). Derfor viste alle paneler en meget signifikant korrelation med ELISA Aβ1-42 og totale tau-niveauer (figur 6B). I modsætning hertil er korrelationen mellem gruppen og MoCA-score relativt dårlig. Et af de mere slående resultater fra disse analyser er det store udvalg af paneloverflod i AsymAD-kohorten. Som vist i figur 6A krydser panelniveauet for AsymAD-gruppen normalt panelniveauet for kontrolgruppen og AD-gruppen, hvilket viser relativt høj variabilitet. For yderligere at udforske denne heterogenitet af AsymAD anvendte vi Multidimensional Scaling (MDS) analyse til 96 CSF replikation 1 tilfælde. MDS-analyse gør det muligt at visualisere ligheden mellem sager baseret på bestemte variabler i datasættet. Til denne klyngeanalyse bruger vi kun de validerede panelmarkører, der har en statistisk signifikant ændring (P <0,05, AD/kontrol) i CSF-opdagelsen og replikation 1 proteom (n = 29) (tabel S2L) niveau. Denne analyse producerede tydelig rumlig klyngedannelse mellem vores kontrol- og AD-tilfælde (figur 6C). I modsætning hertil er nogle AsymAD-tilfælde tydeligt samlet i kontrolgruppen, mens andre er placeret i AD-tilfælde. For yderligere at udforske denne AsymAD-heterogenitet brugte vi vores MDS-kort til at definere to grupper af disse AsymAD-tilfælde. Den første gruppe inkluderede AsymAD-tilfælde, der var grupperet tættere på kontrollen (n = 19), mens den anden gruppe var karakteriseret ved AsymAD-tilfælde med en markørprofil tættere på AD (n = 12).
(A) Ekspressionsniveauet (z-score) for CSF-biomarkørgruppen i alle 96 prøver i CSF-replikation 1-kohorten, inklusive AsymAD. Variansanalyse med Tukeys postkorrektion blev brugt til at evaluere den statistiske signifikans af ændringer i paneloverflod. (B) Korrelationsanalyse af panelproteinoverflodsniveau (z-score) med MoCA-score og totalt tau-niveau i ELISA Aβ1-42 og CSF kopi 1 prøver. Pearson-korrelationskoefficienten med den relevante P-værdi vises. (C) MDS af 96 CSF-kopi 1-tilfælde var baseret på overflodsniveauerne af 29 validerede panelmarkører, som var signifikant ændret i både opdagelses- og CSF-kopi 1-datasættene [P <0,05 AD/kontrol (CT)]. Denne analyse blev brugt til at opdele AsymAD-gruppen i kontrol (n = 19) og AD (n = 12) undergrupper. (D) Vulkanplottet viser den differentielle ekspression af alle CSF-replikation 1-proteiner med log2-fold ændring (x-akse) i forhold til -log10 statistiske P-værdi mellem de to AsymAD-undergrupper. Panelets biomarkører er farvede. (E) CSF-replikation 1 overflodsniveau af selektionsgruppens biomarkører udtrykkes differentielt mellem AsymAD-undergrupper. Tukeys post-justerede variansanalyse blev brugt til at vurdere statistisk signifikans.
Vi undersøgte den differentielle proteinekspression mellem disse kontrol- og AD-lignende AsymAD-tilfælde (figur 6D og tabel S2L). Det resulterende vulkankort viser, at 14 panelmarkører har ændret sig væsentligt mellem de to grupper. De fleste af disse markører er medlemmer af synapsen og metabolomet. SOD1 og myristoyleret alanin-rigt proteinkinase C-substrat (MARCKS), som er medlemmer af henholdsvis myelin- og gliale immungrupper, tilhører imidlertid også denne gruppe (figur 6, D og E). Det vaskulære panel bidrog også med to markører, der var signifikant reduceret i den AD-lignende AsymAD-gruppe, inklusive AE-bindende protein 1 (AEBP1) og komplementfamiliemedlem C9. Der var ingen signifikant forskel mellem kontrol- og AD-lignende AsymAD-undergrupper i ELISA AB1-42 (P = 0,38) og p-tau (P = 0,28), men der var faktisk en signifikant forskel i det totale tau-niveau (P = 0,0031) ) (Fig. S7). Der er flere panelmarkører, der indikerer, at ændringerne mellem de to AsymAD-undergrupper er mere signifikante end de totale tau-niveauer (for eksempel YWHAZ, SOD1 og MDH1) (Figur 6E). Samlet set indikerer disse resultater, at vores validerede panel kan indeholde biomarkører, der kan undertype og potentiel risikostratificering af patienter med asymptomatisk sygdom.
Der er et presserende behov for systembaserede biomarkørværktøjer til bedre at måle og målrette de forskellige patofysiologi bag AD. Disse værktøjer forventes ikke kun at ændre vores AD-diagnostiske rammer, men også fremme vedtagelsen af effektive, patientspecifikke behandlingsstrategier (1, 2). Til dette formål anvendte vi en uvildig omfattende proteomisk tilgang til AD-hjerne og CSF for at identificere webbaserede CSF-biomarkører, der afspejler en bred vifte af hjernebaseret patofysiologi. Vores analyse producerede fem CSF-biomarkørpaneler, som (i) afspejler synapser, blodkar, myelin, immun- og metabolisk dysfunktion; (ii) demonstrere stærk reproducerbarhed på forskellige MS-platforme; (iii) Vis progressive sygdomsspecifikke ændringer gennem de tidlige og sene stadier af AD. Samlet set repræsenterer disse resultater et lovende skridt mod udviklingen af forskellige, pålidelige, web-orienterede biomarkørværktøjer til AD-forskning og kliniske applikationer.
Vores resultater viser den meget bevarede organisation af AD-hjernenetværksproteomet og understøtter dets brug som et anker for systembaseret biomarkørudvikling. Vores analyse viser, at to uafhængige TMT-MS-datasæt indeholdende AD- og AsymAD-hjerne har stærk modularitet. Disse resultater udvider vores tidligere arbejde og demonstrerer bevarelsen af de kraftige moduler af mere end 2.000 hjernevæv fra flere uafhængige kohorter i frontale, parietale og temporale cortex (17). Dette konsensusnetværk afspejler forskellige sygdomsrelaterede ændringer observeret i nuværende forskning, herunder stigningen af glialrige inflammatoriske moduler og faldet i neuronrige moduler. Ligesom den nuværende forskning har dette store netværk også betydelige modulære ændringer i AsymAD, der viser en række forskellige prækliniske patofysiologi (17).
Inden for denne meget konservative systembaserede ramme er der dog mere finkornet biologisk heterogenitet, især blandt individer i de tidlige stadier af AD. Vores biomarkørpanel er i stand til at afbilde to undergrupper i AsymAD, som demonstrerer det signifikante differentielle udtryk for flere CSF-markører. Vores gruppe var i stand til at fremhæve de biologiske forskelle mellem disse to undergrupper, som ikke var tydelige på niveauet af kerne AD-biomarkører. Sammenlignet med kontrolgruppen var Aβ1-42/total tau-forhold for disse AsymAD-individer unormalt lave. Imidlertid var kun de totale tau-niveauer signifikant forskellige mellem de to AsymAD-undergrupper, mens Aβ1-42- og p-tau-niveauerne forblev relativt sammenlignelige. Da høj CSF-tau ser ud til at være en bedre prædiktor for kognitive symptomer end Aβ1-42-niveauer (7), formoder vi, at de to AsymAD-kohorter kan have forskellige risici for sygdomsprogression. I betragtning af den begrænsede stikprøvestørrelse af vores AsymAD og manglen på longitudinelle data, er der behov for yderligere forskning for at drage disse konklusioner med sikkerhed. Disse resultater indikerer imidlertid, at et systembaseret CSF-panel kan forbedre vores evne til effektivt at stratificere individer i det asymptomatiske stadium af sygdommen.
Samlet set understøtter vores resultater rollen af flere biologiske funktioner i patogenesen af AD. Dysreguleret energimetabolisme blev dog det fremtrædende tema for alle vores fem validerede mærkningspaneler. Metaboliske proteiner, såsom hypoxanthin-guanin-phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) og lactatdehydrogenase A (LDHA), er de mest robust validerede synaptiske biomarkører, hvilket indikerer, at stigningen i AD CSF er meget reproducerbar sex. Vores blodkar og gliapaneler indeholder også flere markører involveret i metabolismen af oxidative stoffer. Disse resultater er i overensstemmelse med den nøglerolle, som metaboliske processer spiller i hele hjernen, ikke kun for at imødekomme det høje energibehov fra neuroner, men også for at imødekomme det høje energibehov fra astrocytter og andre gliaceller (17, 48). Vores resultater understøtter voksende beviser på, at ændringer i redoxpotentiale og afbrydelse af energiveje kan være kerneforbindelsen mellem flere nøgleprocesser involveret i patogenesen af AD, herunder mitokondrielle lidelser, glialmedieret inflammation og vaskulær skade (49). Derudover indeholder de metaboliske cerebrospinalvæske biomarkører et stort antal differentielt rige proteiner mellem vores kontrol- og AD-lignende AsymAD-undergrupper, hvilket tyder på, at forstyrrelsen af disse energi- og redox-veje kan være kritisk i det prækliniske stadium af sygdommen.
De forskellige tendenser i hjerne- og cerebrospinalvæskepaneler, vi har observeret, har også interessante biologiske implikationer. Synapser og metabolomer rige på neuroner viser nedsatte niveauer i AD hjernen og øget overflod i cerebrospinalvæske. I betragtning af at neuroner er rige på energiproducerende mitokondrier ved synapser for at give energi til deres talrige specialiserede signaler (50), forventes ligheden mellem ekspressionsprofilerne for disse to neurongrupper. Tabet af neuroner og ekstruderingen af beskadigede celler kan forklare disse hjerne- og CSF-paneltendenser i senere sygdom, men de kan ikke forklare de tidlige panelændringer, vi observerer (13). En mulig forklaring på disse fund i tidlig asymptomatisk sygdom er unormal synaptisk beskæring. Nye beviser i musemodeller tyder på, at mikroglia-medieret synaptisk fagocytose kan aktiveres unormalt i AD og føre til tidligt synapsetab i hjernen (51). Dette kasserede synaptiske materiale kan akkumulere i CSF, hvorfor vi observerer stigningen i CSF i neuronpanelet. Immunmedieret synaptisk beskæring kan også delvist forklare stigningen i gliaproteiner, vi observerer i hjernen og cerebrospinalvæsken gennem hele sygdomsprocessen. Ud over synaptisk beskæring kan overordnede abnormiteter i den eksocytiske vej også føre til forskellige hjerne- og CSF-ekspressioner af neuronale markører. En række undersøgelser har vist, at indholdet af exosomer i patogenesen af AD hjerne har ændret sig (52). Den ekstracellulære vej er også involveret i proliferationen af Aβ (53, 54). Det er værd at bemærke, at undertrykkelse af exosomal sekretion kan reducere AD-lignende patologi i AD transgene musemodeller (55).
Samtidig viste proteinet i det vaskulære panel en moderat stigning i AD-hjernen, men faldt signifikant i CSF. Blod-hjernebarrieren (BBB) dysfunktion kan til dels forklare disse fund. Mange uafhængige postmortem humane undersøgelser har vist BBB-nedbrydning i AD (56, 57). Disse undersøgelser bekræftede forskellige unormale aktiviteter omkring dette tæt forseglede lag af endotelceller, inklusive hjernekapillærlækage og perivaskulær akkumulering af blodbårne proteiner (57). Dette kan give en simpel forklaring på de forhøjede vaskulære proteiner i hjernen, men det kan ikke fuldt ud forklare udtømningen af de samme proteiner i cerebrospinalvæsken. En mulighed er, at centralnervesystemet aktivt isolerer disse molekyler for at løse problemet med øget inflammation og oxidativt stress. Reduktionen i nogle af de mest alvorlige CSF-proteiner i dette panel, især dem, der er involveret i lipoproteinregulering, er relateret til hæmningen af skadelige niveauer af inflammation og den neurobeskyttende proces af reaktive oxygenarter. Dette gælder for Paroxonase 1 (PON1), et lipoproteinbindende enzym, der er ansvarligt for at reducere niveauet af oxidativt stress i kredsløbet (58, 59). Alpha-1-mikroglobulin/bikunin precursor (AMBP) er en anden signifikant nedreguleret markør for den vaskulære gruppe. Det er forløberen for lipidtransportøren bikunin, som også er involveret i inflammationsundertrykkelse og neurologisk beskyttelse (60, 61).
På trods af forskellige interessante hypoteser er manglende evne til direkte at detektere biokemiske sygdomsmekanismer en velkendt begrænsning af opdagelsesdrevet proteomisk analyse. Derfor er yderligere forskning nødvendig for med sikkerhed at definere mekanismerne bag disse biomarkørpaneler. For at bevæge sig mod udviklingen af MS-baseret klinisk analyse kræver den fremtidige retning også brug af målrettede kvantitative metoder til storskala biomarkørverifikation, såsom selektiv eller parallel reaktionsmonitorering (62). Vi brugte for nylig parallel reaktionsovervågning (63) til at validere mange af CSF-proteinændringerne beskrevet her. Adskillige prioriterede panelmål kvantificeres med betydelig nøjagtighed, herunder YWHAZ, ALDOA og SMOC1, som er knyttet til henholdsvis vores synapse-, metabolisme- og inflammationspaneler (63). Uafhængig dataindsamling (DIA) og andre MS-baserede strategier kan også være nyttige til målverifikation. Bud et al. (64) Det blev for nylig påvist, at der er et betydeligt overlap mellem AD-biomarkørerne identificeret i vores CSF-opdagelsesdatasæt og det uafhængige DIA-MS-datasæt, som består af næsten 200 CSF-prøver fra tre forskellige europæiske kohorter. Disse nylige undersøgelser understøtter vores panelers potentiale til at forvandle sig til pålidelig MS-baseret detektion. Traditionel antistof- og aptamer-baseret påvisning er også vigtig for den videre udvikling af vigtige AD-biomarkører. På grund af den lave overflod af CSF er det sværere at detektere disse biomarkører ved hjælp af high-throughput MS-metoder. NEFL og NRGN er to sådanne eksempler på lav-abundance CSF-biomarkører, som er kortlagt til panelet i vores omfattende analyse, men som ikke kan detekteres pålideligt ved hjælp af vores enkelt MS-strategi. Målretningsstrategier baseret på flere antistoffer, såsom PEA, kan fremme den kliniske transformation af disse markører.
Samlet set giver denne undersøgelse en unik proteomisk tilgang til identifikation og verifikation af CSF AD-biomarkører baseret på forskellige systemer. Optimering af disse markørpaneler på tværs af yderligere AD-kohorter og MS-platforme kan vise sig lovende for at fremme AD-risikostratificering og behandling. Undersøgelser, der evaluerer det longitudinelle niveau af disse paneler over tid, er også afgørende for at bestemme, hvilken kombination af markører, der bedst stratificerer risikoen for tidlig sygdom og ændringer i sygdommens sværhedsgrad.
Bortset fra de 3 prøver kopieret af CSF, blev alle CSF-prøver brugt i denne undersøgelse indsamlet i regi af Emory ADRC eller nært beslægtede forskningsinstitutioner. I alt fire sæt Emory CSF-prøver blev brugt i disse proteomiske undersøgelser. CSF-kohorten viste sig at indeholde prøver fra 20 raske kontroller og 20 AD-patienter. CSF-kopi 1 inkluderer prøver fra 32 raske kontroller, 31 AsymAD-individer og 33 AD-individer. CSF kopi 2 indeholder 147 kontroller og 150 AD prøver. Multi-sygdom CSF replikation 4 kohorten inkluderede 18 kontroller, 17 AD, 19 ALS, 13 PD og 11 FTD prøver. I henhold til aftalen godkendt af Emory University Institutional Review Board indhentede alle Emory-undersøgelsesdeltagere informeret samtykke. Ifølge 2014 National Institute of Aging Best Practice Guidelines for Alzheimers Centers (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) blev cerebrospinalvæske opsamlet og opbevaret ved lumbalpunktur. Kontrol- og AsymAD- og AD-patienter modtog standardiseret kognitiv vurdering på Emory Cognitive Neurology Clinic eller Goizueta ADRC. Deres cerebrospinalvæskeprøver blev testet af INNO-BIA AlzBio3 Luminex for ELISA Aβ1-42, total tau og p-tau analyse (65). ELISA-værdier bruges til at understøtte den diagnostiske klassificering af forsøgspersoner baseret på etablerede AD biomarkør cut-off kriterier (66, 67). Grundlæggende demografiske og diagnostiske data for andre CSF-diagnoser (FTD, ALS og PD) indhentes også fra Emory ADRC eller tilknyttede forskningsinstitutioner. De sammenfattende case-metadata for disse Emory CSF-tilfælde kan findes i tabel S1A. Karakteristikaene for den schweiziske CSF-replikation 3-kohorte er tidligere blevet offentliggjort (45).
CSF fandt prøven. For at øge dybden af vores opdagelse af CSF-datasættet blev immunforbrug af proteiner med høj overflod udført før trypsinisering. Kort sagt blev 130 μl CSF fra 40 individuelle CSF-prøver og et lige så stort volumen (130 μl) High Select Top14 Abundance Protein Depletion Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372) placeret i en spin-søjle (Thermo Fisher Scientific, A89868) i rummet temperatur Inkuber). Efter centrifugering i 15 minutter, centrifuger prøven ved 1000 g i 2 minutter. En 3K ultracentrifugal filteranordning (Millipore, UFC500396) blev brugt til at koncentrere spildevandsprøven ved centrifugering ved 14.000 g i 30 minutter. Fortynd alle prøvevolumener til 75 μl med fosfatbufret saltvand. Proteinkoncentrationen blev evalueret ved hjælp af bicinchoninsyre (BCA)-metoden ifølge producentens protokol (Thermo Fisher Scientific). Den immundepleterede CSF (60 μl) fra alle 40 prøver blev fordøjet med lysylendopeptidase (LysC) og trypsin. Kort fortalt blev prøven reduceret og alkyleret med 1,2 μl 0,5 M tris-2(-carboxyethyl)-phosphin og 3 μl 0,8 M chloracetamid ved 90°C i 10 minutter og derefter sonikeret i et vandbad i 15 minutter. Prøven blev fortyndet med 193 μl 8 M urinstofbuffer [8 M urinstof og 100 mM NaHPO4 (pH 8,5)] til en slutkoncentration på 6 M urinstof. LysC (4,5 μg; Wako) bruges til fordøjelse natten over ved stuetemperatur. Prøven blev derefter fortyndet til 1 M urinstof med 50 mM ammoniumbicarbonat (ABC) (68). Tilsæt en tilsvarende mængde (4,5 μg) trypsin (Promega), og inkubér derefter prøven i 12 timer. Forsure den fordøjede peptidopløsning til en slutkoncentration på 1 % myresyre (FA) og 0,1 % trifluoreddikesyre (TFA) (66), og afsaltes derefter med en 50 mg Sep-Pak C18-søjle (Waters) som beskrevet ovenfor (25) . Peptidet blev derefter elueret i 1 ml 50% acetonitril (ACN). For at standardisere proteinkvantificering på tværs af batches (25) blev 100 μl aliquoter fra alle 40 CSF-prøver kombineret for at generere en blandet prøve, som derefter blev opdelt i fem global intern standard (GIS) (48) prøver. Alle individuelle prøver og kombinerede standarder tørres med højhastighedsvakuum (Labconco).
CSF kopierer prøven. Dayon og kolleger har tidligere beskrevet immundepletering og fordøjelse af CSF kopi 3 prøver (45, 46). De resterende replikatprøver var ikke individuelt immundepleteret. Fordøj disse ikke-fjernede prøver i trypsin som beskrevet tidligere (17). For hver gentagen analyse blev 120 μl alikvoter af det eluerede peptid fra hver prøve samlet og opdelt i lige store aliquoter til brug som den TMT-mærkede globale interne standard (48). Alle individuelle prøver og kombinerede standarder tørres med højhastighedsvakuum (Labconco). For at forstærke signalet fra CSF-proteinet med lav overflod, ved at kombinere 125 μl fra hver prøve, blev en "forbedret" prøve forberedt for hver replikatanalyse [dvs. en biologisk prøve, der efterligner forskningsprøven, men den tilgængelige mængde er meget større (37, 69)] slået sammen til en blandet CSF-prøve (17). Den blandede prøve blev derefter immunfjernet under anvendelse af 12 ml High Select Top14 Abundance Protein Removal Resin (Thermo Fisher Scientific, A36372), fordøjet som beskrevet ovenfor og inkluderet i den efterfølgende multiple TMT-mærkning.
Indlægstid: 27. august 2021