Tak fordi du besøger Nature.com. Den browserversion, du bruger, har begrænset CSS-understøttelse. For den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). I mellemtiden, for at sikre fortsat support, vil vi gengive webstedet uden stilarter og JavaScript.
Termofiler er mikroorganismer, der trives ved høje temperaturer. At studere dem kan give værdifuld information om, hvordan livet tilpasser sig ekstreme forhold. Det er dog vanskeligt at opnå høje temperaturforhold med konventionelle optiske mikroskoper. Der er foreslået flere hjemmelavede løsninger baseret på lokal resistiv el-opvarmning, men der er ingen enkel kommerciel løsning. I dette papir introducerer vi konceptet med mikroskala laseropvarmning over mikroskopets synsfelt for at give høje temperaturer til termofile undersøgelser, samtidig med at brugerens miljø holdes mildt. Opvarmning i mikroskala ved moderat laserintensitet kan opnås ved hjælp af et guld nanopartikelbelagt substrat som en biokompatibel og effektiv lysabsorber. Mulige effekter af væskekonvektion i mikroskala, celleretention og centrifugal termoforetisk bevægelse diskuteres. Metoden er blevet demonstreret i to arter: (i) Geobacillus stearothermophilus, en aktiv termofil bakterie, der formerer sig ved ca. 65°C, som vi har observeret at spire, vokse og svømme under mikroskalaopvarmning; (ii) Thiobacillus sp., en optimalt hypertermofil arkæa. ved 80°C. Dette arbejde baner vejen for enkel og sikker observation af termofile mikroorganismer ved hjælp af moderne og overkommelige mikroskopiværktøjer.
I løbet af milliarder af år har livet på Jorden udviklet sig til at tilpasse sig en lang række miljøforhold, som nogle gange betragtes som ekstreme fra vores menneskelige perspektiv. Især nogle termofile mikroorganismer (bakterier, archaea, svampe) kaldet termofile trives i temperaturområdet fra 45°C til 122°C1, 2, 3, 4. Termofile lever i forskellige økosystemer, såsom hydrotermiske dybhavsåbninger, varme kilder eller vulkanske områder. Deres forskning har skabt stor interesse i løbet af de sidste par årtier af mindst to årsager. For det første kan vi lære af dem, for eksempel hvordan termofile 5, 6, enzymer 7, 8 og membraner 9 er stabile ved så høje temperaturer, eller hvordan termofile kan modstå ekstreme niveauer af stråling10. For det andet er de grundlaget for mange vigtige bioteknologiske anvendelser1,11,12 såsom brændstofproduktion13,14,15,16, kemisk syntese (dihydro, alkoholer, metan, aminosyrer osv.)17, biominedrift18 og termostabile biokatalysatorer7 ,11, 13. Især involverer den i øjeblikket velkendte polymerasekædereaktion (PCR)19 et enzym (Taq polymerase) isoleret fra den termofile bakterie Thermus aquaticus, en af de første termofile, der er blevet opdaget.
Studiet af termofile er imidlertid ikke en let opgave og kan ikke improviseres i noget biologisk laboratorium. Navnlig kan levende termofile ikke observeres in vitro med noget standard lysmikroskop, selv med kommercielt tilgængelige varmekamre, normalt vurderet til temperaturer så lave som 40°C. Siden 1990'erne har kun få forskergrupper dedikeret sig til introduktionen af højtemperaturmikroskopi (HTM) systemer. I 1994 Glukh et al. Opvarmnings-/afkølingskammeret blev udtænkt baseret på brugen af en Peltier-celle, der styrer temperaturen på rektangulære kapillærer lukket for at opretholde anaerobicitet 20 . Enheden kan varmes op til 100 °C med en hastighed på 2 °C/s, hvilket giver forfatterne mulighed for at studere motiliteten af den hypertermofile bakterie Thermotoga maritima21. I 1999 havde Horn et al. En meget lignende enhed er blevet udviklet, stadig baseret på brugen af opvarmede kapillærer egnet til kommerciel mikroskopi for at studere celledeling/forbindelse. Efter en lang periode med relativ inaktivitet genoptog søgningen efter effektive HTM'er i 2012, især i forbindelse med en række papirer fra Wirth-gruppen, der brugte en enhed opfundet af Horn et al. For 15 år siden blev bevægeligheden af et stort antal arkæer, inklusive hypertermofiler, undersøgt ved temperaturer op til 100°C ved hjælp af opvarmede kapillærer23,24. De modificerede også det originale mikroskop for at opnå hurtigere opvarmning (adskillige minutter i stedet for 35 minutter for at nå den indstillede temperatur) og opnå en lineær temperaturgradient på mere end 2 cm over mediet. Denne temperaturgradientformningsenhed (TGFD) er blevet brugt til at studere mobiliteten af mange termofile inden for temperaturgradienter ved biologisk relevante afstande 24, 25 .
Opvarmning af lukkede kapillærer er ikke den eneste måde at observere levende termofile. I 2012, Kuwabara et al. Hjemmelavede engangs Pyrex-kamre forseglet med varmebestandigt klæbemiddel (Super X2; Cemedine, Japan) blev brugt. Prøverne blev placeret på en kommercielt tilgængelig gennemsigtig varmeplade (Micro Heat Plate, Kitazato Corporation, Japan), der var i stand til at varme op til 110°C, men ikke oprindeligt beregnet til biobilleddannelse. Forfatterne observerede effektiv deling af anaerobe termofile bakterier (Thermosipho globiformans, fordoblingstid 24 min) ved 65°C. I 2020, Pulshen et al. Effektiv opvarmning af kommercielle metalskåle (AttofluorTM, Thermofisher) blev demonstreret ved hjælp af to hjemmelavede varmeelementer: et låg og en scene (PCR-maskine-inspireret konfiguration). Denne forening resulterer i en ensartet væsketemperatur og forhindrer fordampning og kondens i bunden af låget. Brugen af en O-ring undgår gasudveksling med miljøet. Dette HTM, kaldet Sulfoscope, blev brugt til at afbilde Sulfolobus acidocaldarius ved 75°C27.
En anerkendt begrænsning af alle disse systemer var begrænsningen til brugen af luftobjektiver, idet enhver olienedsænkning var uegnet til så høje temperaturer og til billeddannelse gennem >1 mm tykke gennemsigtige prøver. En anerkendt begrænsning af alle disse systemer var begrænsningen til brugen af luftobjektiver, idet enhver olienedsænkning var uegnet til så høje temperaturer og til billeddannelse gennem >1 mm tykke gennemsigtige prøver. Общепризнанным недостатком всех этих систем было ограничение на использование воздушных объектив, колектив е погружение в масло не подходило для такой высокой температуры и для визуализации через прозрачнцы обрачные >. En erkendt mangel ved alle disse systemer var begrænsningen af brugen af luftmål, da enhver olienedsænkning ikke var egnet til så høje temperaturer og til visualisering gennem transparente prøver > 1 mm tykke.所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜,任何油浸都限制是限制使用空气物镜,任何油浸都业适合踄口毫米厚的透明样品成像. En anerkendt begrænsning ved alle disse systemer er begrænsningen ved at bruge et luftindtaget spejl, da enhver olienedsænkning er uegnet til at afbilde transparente prøver >1 mm tykke ved så høje temperaturer. Общепризнанным недостатком всех этих систем является ограниченное использование воздушных объектин ружение в масло непригодно для таких высоких температур и визуализации через прозрачные образцы мобразци мой дом. En anerkendt ulempe ved alle disse systemer er den begrænsede brug af luftlinser, enhver olienedsænkning er uegnet til så høje temperaturer og visualisering gennem transparente prøver >1 mm tykke.For nylig blev denne begrænsning ophævet af Charles-Orzag et al. 28, som udviklede en enhed, der ikke længere giver varme rundt om systemet af interesse, men derimod inde i selve dækglasset, dækket af et tyndt gennemsigtigt lag af en modstand lavet af ITO (indium-tinoxid). Låget kan varmes op til 75 °C ved at lede en elektrisk strøm gennem det transparente lag. Forfatteren skal dog også opvarme linsen til objektivet, dog ikke mere end 65 °C, for ikke at beskadige den.
Disse værker viser, at udviklingen af effektiv optisk højtemperaturmikroskopi ikke er blevet udbredt, ofte kræver hjemmelavet udstyr og ofte opnås på bekostning af rumlig opløsning, hvilket er en alvorlig ulempe, da termofile mikroorganismer ikke er større end nogle få. mikrometer. Reduceret opvarmningsvolumen er nøglen til at løse tre iboende problemer med HTM: dårlig rumlig opløsning, høj termisk inerti, når systemet opvarmes, og skadelig opvarmning af omgivende elementer (immersionsolie, objektivlinse ... eller brugerens hænder) ved ekstreme temperaturer. ).
I dette papir introducerer vi en HTM til termofil observation, der ikke er baseret på resistiv opvarmning. I stedet opnåede vi lokaliseret opvarmning inden for et begrænset område af mikroskopets synsfelt ved laserbestråling af et lysabsorberende substrat. Temperaturfordelingen blev visualiseret ved hjælp af kvantitativ fasemikroskopi (QPM). Effektiviteten af denne metode demonstreres af Geobacillus stearothermophilus, en bevægelig termofil bakterie, der formerer sig ved ca. 65°C og har en kort fordoblingstid (ca. 20 minutter), og Sulfolobus shibatae, en hypertermofil, der vokser optimalt ved 80°C (archaea) at illustrere. Normal replikationshastighed og svømning blev observeret som en funktion af temperaturen. Denne laser HTM (LA-HTM) er ikke begrænset af tykkelsen af dækglasset eller af objektivets art (luft- eller olienedsænkning). Dette gør det muligt at bruge ethvert højopløsningsobjektiv på markedet. Den lider heller ikke af langsom opvarmning på grund af termisk inerti (opnår øjeblikkelig opvarmning på millisekundskala) og bruger kun kommercielt tilgængelige komponenter. De eneste nye sikkerhedsproblemer er relateret til tilstedeværelsen af kraftige laserstråler (typisk op til 100 mW) inde i enheden og muligvis gennem øjnene, som kræver beskyttelsesbriller.
Princippet i LA-HTM er at bruge en laser til at opvarme prøven lokalt inden for mikroskopets synsfelt (fig. 1a). For at gøre dette skal prøven være lysabsorberende. For at bruge en rimelig lasereffekt (mindre end 100 mW) stolede vi ikke på absorptionen af lys af det flydende medium, men øgede kunstigt absorptionen af prøven ved at belægge substratet med guld-nanopartikler (fig. 1c). Opvarmning af guldnanopartikler med lys er af fundamental betydning for området termisk plasmonik, med forventede anvendelser inden for biomedicin, nanokemi eller høst af sollys29,30,31. I løbet af de sidste par år har vi brugt denne LA-HTM i adskillige undersøgelser relateret til termiske plasmaapplikationer i fysik, kemi og biologi. Den største vanskelighed ved denne metode er at vise den endelige temperaturprofil, da den forhøjede temperatur er begrænset til et mikroskalaområde i prøven. Vi har vist, at temperaturkortlægning kan opnås med det fire-bølgelængde tværgående forskydningsinterferometer, en enkel, høj opløsning og meget følsom metode til kvantitativ fasemikroskopi baseret på brugen af todimensionelle diffraktionsgitre (også kendt som krydsgitter) 33,34,35,36. Pålideligheden af denne termiske mikroskopiteknik, baseret på krydsgitterbølgefrontmikroskopi (CGM), er blevet demonstreret i et dusin artikler offentliggjort i løbet af det sidste årti37,38,39,40,41,42,43.
Ordning for installation af parallel laseropvarmning, formning og temperaturmikroskop. b Prøvegeometri bestående af et AttofluorTM kammer indeholdende et dækglas belagt med guld nanopartikler. c Se nøje på prøven (ikke i skala). d repræsenterer den ensartede laserstråleprofil og (e) den simulerede efterfølgende temperaturfordeling på prøveplanet af guldnanopartiklerne. f er en ringformet laserstråleprofil, der er egnet til at generere en ensartet temperatur som vist i simuleringen af den resulterende temperaturfordeling vist i (g). Målestok: 30 µm.
Især opnåede vi for nylig opvarmning af pattedyrceller med LA-HTM og CGM og sporede cellulære varmechokresponser i området 37-42 °C, hvilket demonstrerer anvendeligheden af denne teknik til billeddannelse af enkeltlevende celler. Anvendelsen af LA-HTM til studiet af mikroorganismer ved høje temperaturer er imidlertid ikke entydig, da det kræver mere forsigtighed sammenlignet med pattedyrceller: For det første fører opvarmning af bunden af mediet med titusindvis af grader (i stedet for et par grader) til en stærk lodret temperaturgradient. kan skabe væskekonvektion 44, som, hvis den ikke er fast fæstnet til substratet, kan forårsage uønsket bevægelse og blanding af bakterier. Denne konvektion kan elimineres ved at reducere tykkelsen af væskelaget. Til dette formål blev bakteriesuspensioner i alle de nedenfor præsenterede eksperimenter anbragt mellem to dækglas med en tykkelse på ca. 15 µm placeret inde i en metalkop (AttofluorTM, Thermofisher, fig. 1b, c). I princippet kan konvektion undgås, hvis væskens tykkelse er mindre end varmelaserens strålestørrelse. For det andet kan arbejde i en sådan begrænset geometri kvæle aerobe organismer (se fig. S2). Dette problem kan undgås ved at bruge et substrat, der er permeabelt for ilt (eller enhver anden vital gas), ved at efterlade indespærrede luftbobler inde i dækglasset eller ved at bore huller i det øverste dækglas (se fig. S1) 45 . I denne undersøgelse valgte vi den sidstnævnte løsning (figur 1b og S1). Endelig giver laseropvarmning ikke ensartet temperaturfordeling. Selv ved den samme intensitet af laserstrålen (fig. 1d) er temperaturfordelingen ikke ensartet, men ligner snarere den gaussiske fordeling på grund af termisk diffusion (fig. 1e). Når målet er at etablere præcise temperaturer i synsfeltet til undersøgelse af biologiske systemer, er ujævne profiler ikke ideelle og kan også føre til termoforetisk bevægelse af bakterier, hvis de ikke klæber til substratet (se fig. S3, S4)39. Til dette formål brugte vi en rumlig lysmodulator (SLM) til at forme den infrarøde laserstråle efter formen af ringen (fig. 1f) i prøvens plan for at opnå en perfekt ensartet temperaturfordeling inden for et givet geometrisk område, trods termisk diffusion (fig. 1d) 39, 42, 46. Placer et topdækglas over en metalskål (figur 1b) for at undgå fordampning af mediet og observer i mindst et par dage. Fordi dette topdækglas ikke er forseglet, kan yderligere medium nemt tilføjes til enhver tid, hvis det er nødvendigt.
For at illustrere, hvordan LA-HTM virker og demonstrere dets anvendelighed i termofil forskning, har vi studeret de aerobe bakterier Geobacillus stearothermophilus, som har en optimal væksttemperatur på omkring 60-65°C. Bakterien har også flageller og evnen til at svømme, hvilket giver endnu en indikator for normal cellulær aktivitet.
Prøver (fig. 1b) blev præ-inkuberet ved 60°C i en time og derefter anbragt i en LA-HTM prøveholder. Denne præ-inkubation er valgfri, men stadig nyttig af to grunde: For det første, når laseren tændes, får det cellerne til straks at vokse og dele sig (se film M1 i Supplerende materialer). Uden præ-inkubation forsinkes bakteriel vækst typisk med ca. 40 minutter, hver gang et nyt synsfelt opvarmes på prøven. For det andet fremmede 1 times præ-inkubation adhæsion af bakterierne til dækglasset, hvilket forhindrede celler i at drive ud af synsfeltet på grund af termoforese, når laseren blev tændt (se film M2 i Supplerende materialer). Termoforese er bevægelsen af partikler eller molekyler langs en temperaturgradient, normalt fra varmt til koldt, og bakterier er ingen undtagelse43,47. Denne uønskede effekt elimineres over et givet område ved at bruge SLM til at forme laserstrålen og opnå en flad temperaturfordeling.
På fig. Figur 2 viser temperaturfordelingen målt ved CGM opnået ved at bestråle et glassubstrat belagt med guldnanopartikler med en ringformet laserstråle (Fig. 1f). En flad temperaturfordeling blev observeret over hele området dækket af laserstrålen. Denne zone blev indstillet til 65°C, den optimale væksttemperatur. Uden for dette område falder temperaturkurven naturligt til \(1/r\) (hvor \(r\) er den radiale koordinat).
et temperaturkort over CGM-målinger opnået ved at bruge en ringformet laserstråle til at bestråle et lag af guld-nanopartikler for at opnå en flad temperaturprofil over et cirkulært område. b Isoterm af temperaturkortet (a). Konturen af laserstrålen er repræsenteret af en grå prikket cirkel. Eksperimentet blev gentaget to gange (se Supplerende materialer, figur S4).
Levedygtigheden af bakterieceller blev overvåget i adskillige timer ved anvendelse af LA-HTM. På fig. 3 viser tidsintervallet for fire billeder taget fra en 3 timers 20 minutters film (Movie M3, Supplerende information). Bakterier blev observeret at aktivt proliferere inden for det cirkulære område defineret af laseren, hvor temperaturen var optimal og nærmede sig 65°C. I modsætning hertil blev cellevækst signifikant reduceret, når temperaturen faldt til under 50°C i 10 s.
Optiske dybdebilleder af G. stearothermophilus bakterier, der vokser efter laseropvarmning på forskellige tidspunkter, (a) t = 0 min, (b) 1 t 10 min, (c) 2 t 20 min, (d) 3 t 20 min, ud af 200 Udtrukket fra en et-minuts film (M3-film leveret i Supplerende Information) overlejret på det tilsvarende temperaturkort. Laseren tænder på tidspunktet \(t=0\). Isotermer er blevet tilføjet til intensitetsbilledet.
For yderligere at kvantificere cellevækst og dens afhængighed af temperatur målte vi stigningen i biomasse af forskellige kolonier af oprindeligt isolerede bakterier i Movie M3 synsfelt (fig. 4). Forælderbakterierne valgt ved starten af dannelsen af minikolonidannende enhed (mCFU) er vist i figur S6. Tørmassemålinger blev taget med et CGM 48 kamera, som blev brugt til at kortlægge temperaturfordelingen. CGM'ens evne til at måle tørvægt og temperatur er styrken af LA-HTM. Som forventet forårsagede høj temperatur hurtigere bakterievækst (fig. 4a). Som vist i semi-log plottet i fig. 4b følger vækst ved alle temperaturer eksponentiel vækst, hvor dataene bruger eksponentialfunktionen \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\), hvor \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) – generationstid (eller fordoblingstid), \( g =1/ \tau\) – vækstrate (antal divisioner pr. tidsenhed ). På fig. 4c viser den respektive væksthastighed og generationstid som funktion af temperaturen. Hurtigt voksende mCFU'er er karakteriseret ved mætning af vækst efter to timer, en forventet adfærd på grund af høj bakteriel tæthed (svarende til den stationære fase i klassiske flydende kulturer). Den generelle form \(g\venstre(T\højre)\) (Fig. 4c) svarer til den forventede tofasekurve for G. stearothermophilus med en optimal væksthastighed omkring 60-65°C. Match dataene ved hjælp af en kardinalmodel (Figur S5)49 hvor \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0,70 ± 0,2; 40 ± 4; 65 ± 1,6; 67 ± 3) °C, hvilket stemmer godt overens med andre værdier citeret i litteraturen49. Selvom de temperaturafhængige parametre er reproducerbare, kan den maksimale væksthastighed på \({G}_{0}\) variere fra et eksperiment til et andet (se figur S7-S9 og film M4). I modsætning til temperaturtilpasningsparametre, som bør være universelle, afhænger den maksimale væksthastighed af mediets egenskaber (tilgængelighed af næringsstoffer, iltkoncentration) inden for den observerede mikroskala geometri.
a Mikrobiel vækst ved forskellige temperaturer. mCFU: Miniature Colony Forming Units. Data opnået fra en video af en enkelt bakterie, der vokser i en temperaturgradient (film M3). b Samme som (a), semi-logaritmisk skala. c Væksthastighed\(\tau\) og generationstid\(g\) beregnet ud fra lineær regression (b). Vandrette fejlbjælker: temperaturområde, over hvilket mCFU'er udvidede sig til synsfeltet under vækst. Lodrette fejlbjælker: lineær regressionsstandardfejl.
Ud over normal vækst flød nogle bakterier nogle gange til syne under laseropvarmning, hvilket er en forventet adfærd for bakterier med flageller. Filmen M5 i yderligere information viser sådanne svømmeaktiviteter. I dette eksperiment blev ensartet laserstråling brugt til at skabe en temperaturgradient, som vist i figur 1d, e og S3. Figur 5 viser to billedsekvenser udvalgt fra M5-filmen, der viser, at en bakterie udviser retningsbestemt bevægelse, mens alle andre bakterier forbliver ubevægelige.
De to tidsrammer (a) og (b) viser svømning af to forskellige bakterier markeret med stiplede cirkler. Billederne blev udtrukket fra M5-filmen (leveret som supplerende materiale).
I tilfældet med G. stearothermophilus begyndte den aktive bevægelse af bakterier (fig. 5) få sekunder efter, at laserstrålen blev tændt. Denne observation understreger den tidsmæssige reaktion af denne termofile mikroorganisme på en stigning i temperatur, som allerede observeret af Mora et al. 24 . Emnet bakteriel motilitet og endda termotaxis kan udforskes yderligere ved hjælp af LA-HTM.
Mikrobiel svømning må ikke forveksles med andre typer fysiske bevægelser, nemlig (i) Brownsk bevægelse, som ser ud til at være kaotisk bevægelse uden nogen bestemt retning, (ii) konvektion 50 og termoforese 43, der består i en regelmæssig drift af bevægelse langs en temperatur gradient.
G. stearothermophilus er kendt for sin evne til at producere meget resistente sporer (sporedannelse), når de udsættes for ugunstige miljøforhold som et forsvar. Når miljøforholdene igen bliver gunstige, spirer sporerne, danner levende celler og genoptager væksten. Selvom denne spordannelses-/spiringsproces er velkendt, er den aldrig blevet observeret i realtid. Ved hjælp af LA-HTM rapporterer vi her den første observation af spiringshændelser i G. stearothermophilus.
På fig. 6a viser time-lapse-billeder af optisk dybde (OT) opnået ved anvendelse af et CGM-sæt på 13 sporer. I hele opsamlingstiden (15 t 6 min, \(t=0\) – begyndelsen af laseropvarmning) spirede 4 ud af 13 sporer, på hinanden følgende tidspunkter \(t=2\) h, \( 3\ ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' og \(11\) h \(30\)'. Selvom kun én af disse hændelser er vist i figur 6, kan 4 spiringshændelser observeres i M6-filmen i det supplerende materiale. Interessant nok ser spiringen ud til at være tilfældig: ikke alle sporer spirer og spirer ikke på samme tid på trods af de samme ændringer i miljøforhold.
en Time-lapse bestående af 8 OT-billeder (olienedsænkning, 60x, 1,25 NA objektiv) og (b) biomasseudvikling af G. stearothermophilus-aggregater. c (b) Tegnet på en semi-log skala for at fremhæve lineariteten af væksthastigheden (stiplet linje).
På fig. 6b, c viser biomassen af cellepopulationer i synsfeltet som en funktion af tiden over hele dataindsamlingsperioden. Det hurtige henfald af den tørre masse observeret ved \(t=5\)h i fig. 6b, c, på grund af nogle cellers udgang fra synsfeltet. Væksthastigheden for disse fire hændelser er \(0,77\pm 0,1\) h-1. Denne værdi er højere end væksthastigheden forbundet med figur 3. 3 og 4, hvor celler vokser normalt. Årsagen til den øgede væksthastighed af G. stearothermophilus fra sporer er uklar, men disse målinger fremhæver interessen for LA-HTM og arbejder på enkeltcelleniveau (eller på enkelt mCFU-niveau) for at lære mere om dynamikken i cellelivet .
For yderligere at demonstrere alsidigheden af LA-HTM og dens ydeevne ved høje temperaturer undersøgte vi væksten af Sulfolobus shibatae, en hypertermofil acidofil arkæa med en optimal væksttemperatur på 80°C51. Sammenlignet med G. stearothermophilus har disse archaea også en meget anderledes morfologi, der ligner 1 mikron kugler (cocci) snarere end aflange stænger (baciller).
Figur 7a består af sekventielle optiske dybdebilleder af S. shibatae mCFU opnået ved hjælp af CGM (se M7 spillefilm i Supplerende materialer). Denne mCFU vokser ved omkring 73°C, under den optimale temperatur på 80°C, men inden for temperaturområdet for aktiv vækst. Vi observerede flere fissionsbegivenheder, der fik mCFU'er til at ligne mikrodruer af archaea efter et par timer. Fra disse OT-billeder blev mCFU-biomasse målt over tid og præsenteret i figur 7b. Interessant nok viste S. shibatae mCFU'er lineær vækst snarere end den eksponentielle vækst set med G. stearothermophilus mCFU'er. Der har været en langvarig diskussion 52 om arten af cellevæksthastigheder: mens nogle undersøgelser rapporterer vækstrater for mikrober, der er proportionale med deres størrelse (eksponentiel vækst), viser andre en konstant hastighed (lineær eller bilineær vækst). Som forklaret af Tzur et al.53, kræver skelnen mellem eksponentiel og (bi)lineær vækst en præcision på <6% i biomassemålinger, hvilket er uden for rækkevidde for de fleste QPM-teknikker, selv involverer interferometri. Som forklaret af Tzur et al.53, kræver skelnen mellem eksponentiel og (bi)lineær vækst en præcision på <6% i biomassemålinger, hvilket er uden for rækkevidde for de fleste QPM-teknikker, selv involverer interferometri. Цур и др.53, различение экспоненциального и (med) линейного роста требует точности <6% вос достижимо для большинства методов QPM, даже с использованием интерферометрии. Som forklaret af Zur et al.53, kræver skelnen mellem eksponentiel og (bi)lineær vækst <6% nøjagtighed i biomassemålinger, hvilket er uopnåeligt for de fleste QPM-metoder, selv ved brug af interferometri.Som forklaret af Zur et al. 53, at skelne mellem eksponentiel og (bi)lineær vækst kræver mindre end 6% nøjagtighed i biomassemålinger, hvilket er uopnåeligt for de fleste QPM-metoder, selv når interferometri bruges. CGM opnår denne nøjagtighed med sub-pg nøjagtighed i biomassemålinger36,48.
en Time-lapse bestående af 6 OT-billeder (olienedsænkning, 60x, NA-mål 1,25) og (b) mikro-CFU-biomasseudvikling målt med CGM. Se film M7 for mere information.
Den perfekt lineære vækst af S. shibatae var uventet og er endnu ikke blevet rapporteret. Imidlertid forventes eksponentiel vækst, i det mindste fordi der over tid skal forekomme multiple divisioner af 2, 4, 8, 16 … celler. Vi antog, at lineær vækst kan skyldes cellehæmning på grund af tæt cellepakning, ligesom cellevækst bremses og til sidst når en hvilende tilstand, når celletætheden er for høj.
Vi afslutter med at diskutere følgende fem interessepunkter på skift: reduktion i opvarmningsvolumen, reduktion i termisk inerti, interesse for guldnanopartikler, interesse for kvantitativ fasemikroskopi og et muligt temperaturområde, hvor LA-HTM kan bruges.
Sammenlignet med resistiv opvarmning giver laseropvarmning, der bruges til HTM-udvikling, flere fordele, som vi illustrerer i denne undersøgelse. Især i flydende medier i mikroskopets synsfelt holdes opvarmningsvolumenet inden for nogle få (10 μm) 3 volumener. På denne måde er kun de observerede mikrober aktive, mens andre bakterier er i dvale og kan bruges til at studere prøven yderligere – der er ingen grund til at ændre prøven, hver gang en ny temperatur skal kontrolleres. Derudover tillader opvarmning i mikroskala direkte undersøgelse af et stort område af temperaturer: Figur 4c blev opnået fra en 3-timers film (film M3), som normalt kræver forberedelse og undersøgelse af flere prøver - en for hver af prøverne, der undersøges. y er temperaturen, der repræsenterer antallet af dage i forsøget. Reduktion af det opvarmede volumen holder også alle de omgivende optiske komponenter i mikroskopet, især objektivlinsen, ved stuetemperatur, hvilket har været et stort problem for samfundet indtil videre. LA-HTM kan bruges med alle linser, inklusive olienedsænkningslinser, og vil forblive ved stuetemperatur selv med ekstreme temperaturer i synsfeltet. Den største begrænsning af laseropvarmningsmetoden, som vi rapporterer i denne undersøgelse, er, at celler, der ikke klæber eller flyder, kan være langt fra synsfeltet og vanskelige at studere. En løsning kunne være at bruge linser med lav forstørrelse for at opnå en større temperaturstigning på over et par hundrede mikrometer. Denne forsigtighed er ledsaget af et fald i rumlig opløsning, men hvis målet er at studere mikroorganismers bevægelse, er høj rumlig opløsning ikke påkrævet.
Tidsskalaen for opvarmning (og afkøling) af systemet \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) afhænger af dets størrelse, ifølge loven \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), hvor \ (L\) er den karakteristiske størrelse af varmekilden (diameteren af laserstrålen i vores undersøgelse er \(L\ ca. 100\) μm), \(D\) er den termiske diffusivitet af miljøet (gennemsnit i vores case, glas og vand Diffusionshastighed\(D\ ca. 2\fold {10}^{-7}\) m2/s Derfor, i denne undersøgelse, tidssvar i størrelsesordenen 50 ms, dvs. næsten øjeblikkelige). temperaturændringer, kan forventes. Denne øjeblikkelige etablering af temperaturstigning forkorter ikke blot varigheden af eksperimentet, men tillader også præcis timing \(t=0\) for enhver dynamisk undersøgelse af temperatureffekter.
Vores foreslåede metode er anvendelig til ethvert lysabsorberende substrat (for eksempel kommercielle prøver med ITO-belægning). Guld nanopartikler er imidlertid i stand til at give høj absorption i det infrarøde og lav absorption i det synlige område, hvis sidstnævnte karakteristika er af interesse for effektiv optisk observation i det synlige område, især ved brug af fluorescens. Derudover er guld biokompatibelt, kemisk inert, optisk tæthed kan justeres fra 530 nm til nær infrarød, og prøveforberedelse er enkel og økonomisk29.
Tværgitterbølgefrontmikroskopi (CGM) tillader ikke kun temperaturkortlægning i mikroskala, men også biomasseovervågning, hvilket gør det særligt nyttigt (hvis ikke nødvendigt) i kombination med LA-HTM. I løbet af det sidste årti er andre temperaturmikroskopiteknikker blevet udviklet, især inden for bioimaging, og de fleste af dem kræver brug af temperaturfølsomme fluorescerende prober54,55. Imidlertid er disse metoder blevet kritiseret, og nogle rapporter har målt urealistiske temperaturændringer i celler, muligvis på grund af det faktum, at fluorescens afhænger af mange andre faktorer end temperatur. Derudover er de fleste fluorescerende prober ustabile ved høje temperaturer. Derfor repræsenterer QPM og især CGM en ideel temperaturmikroskopiteknik til at studere liv ved høje temperaturer ved hjælp af optisk mikroskopi.
Studier af S. shibatae, som lever optimalt ved 80°C, viser, at LA-HTM kan anvendes til at studere hypertermofiler, ikke kun simple termofile. I princippet er der ingen grænse for rækkevidden af temperaturer, der kan nås ved hjælp af LA-HTM, og selv temperaturer over 100°C kan nås ved atmosfærisk tryk uden kogning, som demonstreret af vores gruppe på 38 i hydrotermisk kemi-applikationer ved atmosfærisk tryk A. En laser bruges til opvarmning af guld nanopartikler 40 på samme måde. Således har LA-HTM potentialet til at blive brugt til at observere hidtil usete hypertermofiler med standard højopløsnings optisk mikroskopi under standardbetingelser (dvs. under miljøbelastning).
Alle eksperimenter blev udført ved hjælp af et hjemmelavet mikroskop, inklusive Köhler-belysning (med LED, M625L3, Thorlabs, 700 mW), prøveholder med manuel xy-bevægelse, objektiver (Olympus, 60x, 0,7 NA, luft, LUCPlanFLN60X eller 60x, Oil NA, 1,25 NA , UPLFLN60XOI), CGM-kamera (QLSI-krydsgitter, 39 µm pitch, 0,87 mm fra Andor Zyla-kamerasensor) til at give intensitet og bølgefrontbillede, og sCMOS-kamera (ORCA Flash 4.0 V3, 16-bit-tilstand, fra Hamamatsu) til at optage data vist i figur 5 (bakteriel svømning). Den dikroiske stråledeler er en 749 nm BrightLine-kant (Semrock, FF749-SDi01). Filteret på forsiden af kameraet er et 694 kortpasfilter (FF02-694/SP-25, Semrock). Titanium safir laser (Laser Verdi G10, 532 nm, 10 W, pumpet tsunami laser hulrum, Spectra-Physics i Fig. 2-5, yderligere erstattet af Millenia laser, Spectraphysics 10 W, pumpet Mira laser hulrum, Kohærent, for Fig. 2 -5). 6 og 7) indstilles til bølgelængden \({{{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) nm, som svarer til plasmonresonansspektret for guld-nanopartikler. Rumlige lysmodulatorer (1920 × 1152 pixels) blev købt fra Meadowlark Optics. Hologrammerne blev beregnet ved hjælp af Gerchberg-Saxton-algoritmen som beskrevet i linket 39.
Cross grating wavefront microscopy (CGM) er en optisk mikroskopiteknik baseret på at kombinere et todimensionelt diffraktionsgitter (også kendt som krydsgitter) i en afstand af en millimeter fra et konventionelt kameras sensor. Det mest almindelige eksempel på en CGM, som vi har brugt i denne undersøgelse, kaldes et fire-bølgelængde transversal shift-interferometer (QLSI), hvor krydsgitteret består af et intensitets/fase-skakternmønster introduceret og patenteret af Primot et al. i 200034. De lodrette og vandrette gitterlinjer skaber gitterlignende skygger på sensoren, hvis forvrængning kan behandles numerisk i realtid for at opnå den optiske bølgefrontforvrængning (eller tilsvarende faseprofil) af det indfaldende lys. Når det bruges på et mikroskop, kan et CGM-kamera vise den optiske vejforskel for et afbildet objekt, også kendt som optisk dybde (OT), med en følsomhed i størrelsesordenen nanometer36. I enhver CGM-måling skal et primært reference-OT-billede tages og trækkes fra eventuelle efterfølgende billeder for at eliminere eventuelle defekter i de optiske komponenter eller stråler.
Temperaturmikroskopi blev udført under anvendelse af et CGM-kamera som beskrevet i referencen. 32. Kort sagt, opvarmning af en væske ændrer dens brydningsindeks, hvilket skaber en termisk linseeffekt, der forvrænger den indfaldende stråle. Denne bølgefrontforvrængning måles af CGM og behandles ved hjælp af en deconvolution-algoritme for at opnå en tredimensionel temperaturfordeling i det flydende medium. Hvis guldnanopartiklerne er jævnt fordelt i prøven, kan temperaturkortlægning udføres i bakteriefrie områder for at producere bedre billeder, hvilket vi nogle gange gør. Reference CGM-billedet blev optaget uden opvarmning (med laseren slukket) og efterfølgende optaget på samme sted i billedet med laseren tændt.
Måling af tørmasse opnås ved hjælp af det samme CGM-kamera, der bruges til temperaturbilleddannelse. CGM-referencebilleder blev opnået ved hurtigt at flytte prøven i x og y under eksponering som et middel til at beregne et gennemsnit af enhver inhomogenitet i OT på grund af tilstedeværelsen af bakterier. Fra OT-billeder af bakterier blev deres biomasse opnået ved hjælp af et ensemble af billeder over områder udvalgt ved hjælp af Matlabs hjemmelavede segmenteringsalgoritme (se underafsnit "Numerisk kode") efter proceduren beskrevet i ref. 48. Kort sagt bruger vi relationen \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), hvor \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) er det optiske dybdebillede, \(m\) er tørvægten og \({{{{{\rm{\alpha }}}}}}\) er en konstant. Vi valgte \({{{{\rm{\alpha))))))=0,18\) µm3/pg, som er en typisk konstant for levende celler.
Et dækglas på 25 mm i diameter og 150 µm tykt belagt med guldnanopartikler blev anbragt i et AttofluorTM-kammer (Thermofisher) med guldnanopartiklerne opad. Geobacillus stearothermophilus blev fordyrket natten over i LB-medium (200 rpm, 60°C) før hver dag med eksperimenter. En dråbe på 5 µl af en suspension af G. stearothermophilus med en optisk densitet (OD) på 0,3 til 0,5 blev anbragt på et dækglas med guld-nanopartikler. Derefter blev et rundt dækglas på 18 mm i diameter med et hul på 5 mm i diameter i midten faldet på dråben, og 5 μl bakteriesuspension med samme optiske tæthed blev gentagne gange påført midten af hullet. Brøndene på dækglas blev forberedt i overensstemmelse med proceduren beskrevet i ref. 45 (se Supplerende oplysninger for mere information). Tilsæt derefter 1 ml LB medium til dækglasset for at forhindre væskelaget i at tørre ud. Det sidste dækglas placeres over det lukkede låg på Attofluor™-kammeret for at forhindre fordampning af mediet under inkubation. Til spireforsøg brugte vi sporer, som efter konventionelle forsøg nogle gange dækkede det øverste dækglas. En lignende metode blev brugt til at opnå Sulfolobus shibatae. Tre dage (200 rpm, 75°C) med præliminær dyrkning af Thiobacillus serrata blev udført i medium 182 (DSMZ).
Prøver af guldnanopartikler blev fremstillet ved micellær blokcopolymerlitografi. Denne proces er beskrevet detaljeret i kap. 60. Kort fortalt blev miceller, der indkapslede guldioner, syntetiseret ved at blande copolymeren med HAuCl4 i toluen. De rensede dækglas blev derefter nedsænket i opløsningen og behandlet med UV-bestråling i nærværelse af et reduktionsmiddel for at opnå guldfrø. Endelig blev guldfrø dyrket ved at bringe et dækglas i kontakt med en vandig opløsning af KAuCl4 og ethanolamin i 16 minutter, hvilket resulterede i et kvasi-periodisk og meget ensartet arrangement af ikke-sfæriske guldnanopartikler i det nære infrarøde.
For at konvertere interferogrammerne til OT-billeder brugte vi en hjemmelavet algoritme, som beskrevet i linket. 33 og er tilgængelig som en Matlab-pakke i følgende offentlige lager: https://github.com/baffou/CGMprocess. Pakken kan beregne intensitets- og OT-billeder baseret på optagede interferogrammer (inklusive referencebilleder) og kameraarrayafstande.
For at beregne fasemønsteret anvendt på SLM for at opnå en given temperaturprofil, brugte vi en tidligere udviklet hjemmelavet algoritme39,42, som er tilgængelig i følgende offentlige depot: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. Indgangen er det ønskede temperaturfelt, som kan indstilles digitalt eller via et monokromt bmp-billede.
For at segmentere cellerne og måle deres tørvægt brugte vi vores Matlab-algoritme offentliggjort i følgende offentlige depot: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. På hvert billede skal brugeren klikke på bakterien eller mCFU af interesse, justere tryllestavens følsomhed og bekræfte valget.
For mere information om undersøgelsesdesign, se Nature Research Report-abstraktet, der er knyttet til denne artikel.
Data, der understøtter resultaterne af denne undersøgelse, er tilgængelige fra de respektive forfattere efter rimelig anmodning.
Kildekoden, der bruges i denne undersøgelse, er detaljeret i metodeafsnittet, og debug-versioner kan downloades fra https://github.com/baffou/ i følgende depoter: SLM_temperatureShaping, CGMprocess og CGM_magicWandSegmentation.
Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Indsigt i termofile og deres bredspektrede anvendelser. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK Indsigt i termofile og deres bredspektrede anvendelser.Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. og Sharma, AK Oversigt over termofile og deres brede anvendelse. Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用。 Mehta, R., Singhal, P., Singh, H., Damle, D. & Sharma, AK.Mehta R., Singhal P., Singh H., Damle D. og Sharma AK En dyb forståelse af termofile og en bred vifte af applikationer.3 Biotechnology 6, 81 (2016).
Indlægstid: 26. september 2022